Рис. 1. Ультраструктурная картина участка передней стромы опытной роговицы через 1 неделю после процедуры фемтокросслинкинга. Сшивки коллагена под эпителием (А) и в поверхностных слоях стромы (В) (электронная трансмиссионная микроскопия, увеличение х6000)
Рис. 2. Электронно —микроскопическая картина участка стромы опытного животного через 1 мес. после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера. Сшивки (обозначены стрелками) волокон коллагена поверхностной стромы роговой оболочки (электронная трансмиссионная микроскопия, увеличение х6000)
Несмотря на то, что КРК зарекомендовал себя в клинической практике, по —прежнему предпринимаются усилия для изменения стандартного протокола, чтобы повысить безопасность и комфорт пациентов [6]. Широко распространенный Цюрихский протокол для КРК включает удаление эпителия роговицы для облегчения проникновения рибофлавина в строму [13]. Однако деэпителизация сопровождается болью, ощущением инородного тела, дискомфортом в виде жжения и слезотечения в течение нескольких дней. Кроме того, при удалении эпителия уменьшается общая толщина роговицы, а последующее проведение КРК на тонкой роговице может быть причиной рубцов роговой оболочки, повреждения эндотелия и даже перфорации [4, 8, 9]. Поэтому исследователи и клиницисты в настоящее время заинтересованы в разработке варианта КРК без деэпителизации при сохранении эффективности стандартного подхода. Известна методика трансэпителиального кросслинкинга, при которой перед закапыванием рибофлавина для разрыхления эпителия роговицы инстиллируют сначала раствор тетракаина в течение 30 минут [3, 5, 10]. Однако при применении данной методики достигается только одна пятая часть биомеханического эффекта [16].
В связи с этим рядом авторов была предложена методика роговичного кросслинкинга без удаления эпителия с фемтосекундным формированием интрастромального кармана для введения 0,1% раствора рибофлавина с последующим ультрафиолетовым облучением, которая выглядит актуальной [1, 2, 7].
Цель – изучение структуры тканей роговицы после фемтокросслинкинга в эксперименте.
Материал и методы
В работе использовали самцов кроликов породы Шиншилла массой 2 —3 кг. Исследования выполняли на 12 глазах 6 кроликов. Животные были разделены на 2 разные группы по 3 кролика в каждой:
1. Опытная группа – кролики, которым проводилась процедура кросслинкинга с применением фемтолазера [14].
2. Контрольная группа – кролики, которым проводилось только фемтолазерное формирование кармана без процедуры кросслинкинга.
Срок наблюдения составил 1 неделю, 1 и 3 мес.
Рис. 3. Электронно —микроскопическая картина участка стромы опытного животного через 3 мес. после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера. Сшивки (обозначены стрелками) волокон коллагена поверхностной стромы роговой оболочки (электронная трансмиссионная микроскопия, увеличение х6000)
Рис. 4. Электронно —микроскопическая картина участка стромы опытного животного через 3 мес. после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера. Сшивки (обозначены стрелками) волокон коллагена поверхностной стромы роговой оболочки (электронная трансмиссионная микроскопия, увеличение х8000)
Во 2 —й группе животным проводили только процедуру формирования роговичного кармана на заданной глубине (100 —110 мкм) и диаметром 9,0 мм с уголом вреза 45 градусов, уголом петли 45 градусов с помощью фемтосекундного лазера – IntraLasе FS 60.
На сроках 1 неделя, 1 и 3 мес. кроликов выводили из эксперимента воздушной эмболией, глаза энуклеировали, роговицы вырезали с помощью трепана 9,0 мм. Выкроенные роговицы фиксировали в растворе глютаральдегида на фосфатном буфере в течение 24 часов, далее фиксировали осмием и готовили препараты для электронной микроскопии. Гистоморфологические исследования делали на трансмиссионном электронном микроскопе JЕOL 1200 EX (Япония) на базе Института биотехнологии РАН (Москва).
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных электронно —микроскопических исследований показали, что через неделю после операции у животных 1 группы сразу под эпителием идет формирование продольных и поперечных сшивок коллагена, которые сконцентрированы вблизи базальной мембраны эпителия (рис. 1).
К 1 мес. после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера сшивки коллагена в основном представлены в поверхностных слоях стромы (рис. 2).
На сроке 3 мес. после процедуры сформированные сшивки сохраняются, вероятно, без влияния на них процессов ремоделирования (рис. 3).
При большем увеличении в поверхностных слоях стромы определялись пласты сшитых волокон и пучков коллагена (рис. 4). Часть волокон сшито бок в бок, другая часть – конец в конец. На всех сроках наблюдения на препаратах 1 группы не обнаруживали явлений воспаления либо других осложнений.
В роговицах кроликов контрольной группы заживление эпителия и роговичной стромы на всех сроках после фемтолазерного формирования кармана, без последующей процедуры кросслинкинга, проходило без каких —либо особенностей. А именно через 1 неделю в зоне фемтолазерного формирования кармана определялись некротические отложения в строме между коллагеновыми фибриллами, вызванные деструктивными изменениями после воздействия фемтосекундного лазера. Изменения эпителия и субэпителиального слоя над стромальным карманом не визуализировались. Через 1 мес. после фемтолазерного формирования кармана эпителий и субэпителиальный слой, а также ход волокон в зоне формирования кармана не были изменены, определялись единичные кератобласты (рис. 5).
Заключение
1. Фемтолазерное формирование кармана в роговичной строме для интрастромального введения рибофлавина является безопасной процедурой.
2. Наличие сформировавшихся сшивок волокон коллагена роговичного коллагена под воздействием фемтокросслинкинга, сохраняющихся до 3 —х мес. без изменений, говорит об эффективности новой методики.
