Online трансляция


Глаукома: теории, тенденции, технологии

Глаукома: теории, тенденции, технологии

7-8 декабря 2018 г.
Трансляция проводится из трех залов:
7 декабря - Зал Сокольники
7,8 декабря - Зал Арбат
7 декабря - Зал Чистые Пруды


Партнеры


Surgix Монолит Optec R-optics Valeant thea Allergan Фокус santen tradomed sentiss sentiss






Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 30 2018
№ 29 2018
№ 28 2017
№ 27 2017
№ 26 2017
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 3 2018 г.
№ 2 2018 г.
№ 1 2018 г.
№ 4 2017 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 3 2018 г.
№ 2 2018 г.
№ 1 2018 г.
№ 4 2017 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 3 2018
№ 2 2018
№ 1 2018
№ 4 2017
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 5 2018
№ 4 2018
№ 3 2018
№ 2 2018
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2018
Выпуск 3. 2018
Выпуск 2. 2018
Выпуск 1. 2018
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (45) 2018
№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№4 (41) Октябрь 2018
№3 (40) Сентябрь 2018
№2 (39) Июнь 2018
№1 (38) Март 2018
№5 (37) Декабрь 2017
№4 (36) Октябрь 2017
№3 (35) Август 2017
№2 (34) Май 2017
№1 (33) Март 2017
....
Отражение Отражение
№ 1 (6) 2018
....


facebooklogo     youtubelogo



Сборники статей


Год
2016

Предоперационная подготовка аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации


Органзации: В оригинале: ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность темы
    Слой ретинального пигментного эпителия (РПЭ) играет значительную роль в жизнедеятельности сетчатой оболочки глаза, обеспечивая, по меньшей мере, пять физиологических функций (Simo R, Villarroel M, Corraliza L et al., 2010; Strauss O, 2011). Дисфункция РПЭ считается центральным звеном в патогенезе дегенеративных заболеваний сетчатки (Nowak JZ, 2006). Количество таких больных в России и в мире исчисляется миллионами и имеет тенденцию к росту (Либман Е.С., Шахова Е.В., 2000, 2003; Bourne RR, Stevens GA, White RA et al, 2013; Wong WL, Su X, Li X et al, 2014).

    Несмотря на наличие множества клинических методов консервативного, лазерного и хирургического лечения дегенеративных заболеваний сетчатки (Macular Photocoagulation Study Group, 1991, 1994; Age-Related Eye Disease Study Research Group, 2008; Eyetech Study Group, 2002, 2003), в настоящее время отсутствуют радикальные способы возврата утраченных зрительных функций или эффективного предотвращения их потери.

    Трансплантация пигментного эпителия сетчатки – это инновационный, патогенетически обоснованный метод лечения дегенераций сетчатки на стыке микрохирургии глаза и клеточной биологии, который имеет ряд нерешенных проблем: 1) выбор клеточного материала, который был бы этически допустим к клинической практике; 2) ограничение спонтанной диссеминации трансплантированных клеток; 3) соблюдение микроинвазивности вмешательства; 4) решение проблемы эпителиально-мезенхимальной трансформации (пластичности).

    Наилучшие результаты при трансплантации РПЭ были достигнуты при трансплантации фетального материала, однако использование этого источника имеет этические ограничения (Paulesu L, Ietta F, Petraglia F, 2005). Трансплантация РПЭ в форме клеточной суспензии в ряде случаев приводит к спонтанной диссеминации материала и, как следствие, развитию пролиферативного процесса в витреальной полости (Falkner-Radler CI, Krebs I, Glittenberg C et al., 2011). Также при имплантации суспензии в ней часто обнаруживается преобладание клеток мезенхимального фенотипа, что является следствием эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток РПЭ после удаления их с поверхности нативной мембраны Бруха (Chen HC, Zhu YT, Chen SY, 2012). Трансплантация РПЭ в составе тканевых лоскутов сопровождается большим травматизмом и вероятностью хирургических осложнений (Caramoy A, Liakopoulos S, Menrath E, 2010).

    С.А. Борзенком (2012) была высказана гипотеза о том, что использование в качестве трансплантируемого материала клеток аллогенного РПЭ взрослого донора-трупа, культивированного в форме многоклеточных микроагрегатов округлой формы (сфероидов) способно дать компромиссное решение всех четырех проблем.

    Сфероиды имеют диаметр в несколько сотен микрометров, что могло бы позволить инъецировать их в субретинальное пространство с помощью современных микроинвазивных техник. Клетки внутри сфероида объединены межклеточными связями, что не дает им спонтанно диссеминировать, а общая масса сфероида заставляет его быстро оседать в толще жидкости. Клетки в составе сфероида также различаются по морфологии – центральные имеют мезенхимальный фенотип, а поверхностные – эпителиальный, что позволяет решить проблему эпителиально-мезенхимальной трансформации (Lin RZ, Chu WC, Chiang CC et al., 2008; Lin RZ, Chang HY, 2008; Сабурина И.Н., 2010)

    Отсутствие в доступной литературе сведений об использовании РПЭ для трансплантации в субретинальное пространство в форме сфероидов и недостаток информации о трехмерном культивировании РПЭ обусловили выбор цели данного исследования
Цели и задачи исследования
    Цель работы. Разработка технологии предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации.

    Задачи исследования:

    1. Разработать технику микрохирургического выделения клеток ретинального пигментного эпителия из трупных донорских глаз человека для трансплантации.

    2. Разработать технологию подготовки ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования.

    3. Изучить в эксперименте морфологические критерии трансплантабельности 3D клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия, подготовленных по предложенной технологии.

    4. Изучить в эксперименте процесс реконструкции фрагмента слоя ретинального пигментного эпителия при помощи сфероидов в условиях in vitro.

    5. Изучить в эксперименте адгезивные свойства клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса
Научная новизна
    1. Впервые разработана методика выделения ретинального пигментного эпителия из глаза донора-трупа методом наружного доступа без повреждения сетчатой оболочки и стекловидного тела.

    2. Впервые разработана методика подготовки ретинального пигментного эпителия донора-трупа методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации в субретинальное пространство.

    3. Впервые определены морфологические критерии трансплантабельности клеточных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия, полученных по предложенной технологии.

    4. Впервые изучен процесс реконструкции фрагмента слоя ретинального пигментного эпителия при помощи клеточных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия in vitro и в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса глаза донора-трупа.

    5. Впервые доказана принципиальная возможность использования клеточных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия для реконструкции пигментного слоя на поверхности мембраны Бруха.
Практическая значимость
    1. Разработан протокол выделения ретинального пигментного эпителия из глаза донора-трупа.

    2. Разработан протокол получения клеточных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия донора-трупа для трансплантации.

    3. Разработаны морфологические критерии трансплантабельности клеточных микроагрегатов ретинального пигментного эпителия, получаемых по предложенной технологии.

    4. Разработана модель органной культуры хороидально-пигментного комплекса глаза донора-трупа для изучения процессов краткосрочной реконструкции слоя ретинального пигментного эпителия.
Апробация диссертации
    Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на следующих конференциях, симпозиумах и съездах: на научно-практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум» (г. Москва, 2014); на ежегодном съезде Ассоциации по научным исследованиям в области зрения и офтальмологии (The Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO; г. Денвер, США, 2015); на X Съезде офтальмологов России (г. Москва, 2015).
Структура и объем работы
    Текст диссертации изложен на 175 страницах, содержит 25 таблиц и 36 рисунков. Работа состоит из введения и 3 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, содержит общее заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы состоит из 295 источников, включающих 22 отечественных и 275 иностранных публикации.
Положения, выносимые на защиту
    1. Предложенный способ выделения клеток РПЭ из глаза донора-трупа позволяет получать суспензию жизнеспособных клеток РПЭ с пониженным уровнем загрязнения сторонними пролиферативно-активными элементами и конструировать 3D сфероиды из клеток РПЭ с различными морфо-функциональными характеристиками и высокой трансплантабельностью.

    2. Установленные параметры трехмерного культивирования позволяют получать для трансплантации сфероиды РПЭ из исходного посевного количества клеток 500–1000 на одну висячую каплю и проводить трехмерное клеточное культивирование в течение 7-14 суток для формирования сфероидов с «гладкой» поверхностью.

    3. При имплантации сфероидов РПЭ с высокими показателями трансплантабельности на поверхность мембраны Бруха хороидально-пигментного комплекса донора-трупа в условиях органной культуры происходит адгезия сфероидов и локальное образование слоя ретинального пигментного эпителия вокруг них.

Содержание работы


Материалы и методы экспериментальных исследований
    Все исследования проводились в 2013-2015 годах на базе лабораторий Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ЦМБП) Межотраслевого научно-технического комплекса «Микрохирургия глаза», г. Москва, под руководством руководителя ЦМБП д.м.н., профессора С.А. Борзенка.

    Иммуноцитохимические исследования проводились на базе Лаборатории биологии и патологии развития Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии (г. Москва) под руководством заведующей лабораторией д.б.н. И.Н. Сабуриной.

    Исследования проводились в пять этапов и соответстветствовали пяти поставленным задачам.

    1 этап. Разработка техники выделения клеток РПЭ из глазных яблок доноров-трупов для трансплантации. Для выделения клеток РПЭ отбирали ГЯДТ, удовлетворяющие признакам: 1) донор успешно прошел этап проверки на инфекционную безопасность; 2) донор моложе 50 лет; 3) ГЯДТ имеет показатели адреналиновой пробы по С.А. Борзенку А и В; 4) ГЯДТ энуклеировано и помещено в условия гипотермии не позднее 12 часов post mortem и пребывало в гипотермии не более 48 часов; 5) при внешнем осмотре ГЯДТ после выкраивания роговично-склерального диска не имеет признаков ятрогенного повреждения передней гиалоидной мембраны, пролапса стекловидного тела, отслоения сетчатой и/или сосудистой оболочек.

    Для выделения РПЭ по оригинальной методике (опытная группа) было использовано 11 ГЯДТ от 11 доноров, разделенных на две группы по показателям адреналиновой пробы (Борзенок С.А., 2008) – Проба А (6 глаз) и Проба В (5 глаз). Среднее время от момента энуклеации составило 6,2±1,4 и 8,0±2,7 часов, соответственно; средний возраст донора - 34,5±10,5 и 39,4±4,5 лет, соответственно. В качестве контрольной использовали известную методику выделения РПЭ «передним» доступом - удаляли передний отрезок ГЯДТ, сетчатку, стекловидное тело, таким образом формируя глазной бокал, из которого ферментативно отделяли РПЭ (Александрова М.А. с соавт., 2009). В контрольной группе было использовано 11 парных глаз от тех же 11 доноров, что и в опытной. Для препарирования использовали стандартный офтальмохирургический инструментарий и стандартные методы оперативной хирургии.

    Суспензию клеток РПЭ, получаемую по оригинальной и известной методикам, сравнивали по уровню жизнеспособности клеток в стандартном тесте с окраской трипановым синим.

    2 этап. Подготовка ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования. Клетки РПЭ, полученные в опытной группе на первом этапе, культивировали и субкультивировали до 6 пассажа (P1-P6) стандартными методами клеточной биологии на дне полистироловых чашек Петри (всего было получено 11 двухмерных (2D) конфлюэнтных культур РПЭ, содержащих от 5*106 до 8,8*10 6 клеток каждая). Использовали питательную среду на основе полной ростовой среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему с L-глутамином (DMEM/F12; 89% об.) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (10 % об.) и смеси антибиотиков (1,0 % об). Инкубировали в стандартных условиях (37 о С, 5% концентрация СО2 ). Смену питательной среды проводили каждые 3-4 дня.

    По разработанной методике из клеток РПЭ 2D-культур формировали 3D-культуры в форме висячих капель.

    Процесс формирования микроагрегатов РПЭ внутри висячих капель наблюдали и фоторегистрировали ежедневно при помощи инвертированного микроскопа со встроенной цифровой фотокамерой. Диаметр сфероидов измеряли цифровым калипером по фотографиям.

    Для молекулярной идентификации и для изучения динамики клеточного фенотипа образцы 2D культур РПЭ пассажей P0 и P6 (по 10 образцов), а также сфероиды РПЭ (по 100-200 штук) на вторые и седьмые сутки 3D-культивирования фиксировали 4% раствором параформальдегида, окрашивали на ряд иммуноцитохимических маркеров (специфический маркер РПЭ - RPE65; маркеры эпителиальных тканей ZO-1 и E-кадгерин; маркер мезенхимальных тканей виментин), связанных с флуоресцентными красителями (флуоресцеина изотиоцианат, FITC – зеленый краситель, DyLight 594 – красный) и изучали на конфокальном микроскопе во флуоресцентном режиме.

    3 этап. Разработка критериев трансплантабельности сфероидов ретинального пигментного эпителия. Использованные ранее 2D-культуры клеток РПЭ были разделены на две группы, согласно результатам адреналиновой пробы донорских глаз, из которых они были получены – на группу А и группу В (6 культур в группе А, 5 культур в группе В). Из каждой клеточной культуры (11 культур) по протоколу, описанному ранее, формировали по 16 сфероидов различных посевных количеств клеток (500, 1000, 5000, 25000, 125000 клеток на висячую каплю) и обоих типов морфологии. Всего было отобрано 1760 сфероидов РПЭ.

    По 12 сфероидов из Группы А и по 10 из Группы В (по 2 сфероида одного посевного количества от каждого донора) извлекали из 3D культуры в различные сроки (7, 14, 21 и 28 дней), переносили в пробирки (1,5 мл) с фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) для отмывания остатков питательной среды (сфероиды одной группы смешивали в одной пробирке), затем в пробирку со смесью 0,25% трипсина-ЭДТА и Версена (1:1 по об.), инкубировали в стандартных условиях в течение 5 минут, дезагрегировали клетки пипетированием и проводили тест на жизнеспособность с трипановым синим.

    По 12 других сфероидов из Группы А и по 10 из Группы B различных посевных количеств клеток и раличной морфологии извлекали из 3D культуры в различные сроки (7,14,21 и 28 дней) и переносили на дно лунок 24 -луночных планшетов по одному сфероиду в лунку. Начальные этапы адгезии сфероидов определяли микроскопически по прекращению их свободной флуктуации в растворе при действии низкочастотных механических колебаний, а также по появлению первых признаков распластывания (спрединга) клеточного слоя вокруг сфероида.

    4 этап. Изучение процесса реконструкции клеточного слоя при помощи сфероидов ретинального пигментного эпителия in vitro. По методике, разработанной на втором этапе, было получено 33 «гладких» сфероида РПЭ (по 3 сфероида от каждого донора) с посевным количеством 1000 клеток на висячую каплю, изъятых из висячих капель на 7 сутки 3D культивирования и перенесенных в 2D условия – на дно лунок 24-луночного культурального планшета по 1 (Группа «1») и по 2 (Группа «2») сфероида от каждого донора в лунку (всего 22 лунки). Площадь дна одной лунки планшета 2 см 2 (2*10 8 мкм 2 ). В каждую лунку добавляли 500 мкл питательной среды , инкубировали в стандартных условиях, замену питательной среды производили каждые 3-4 дня.

    В последующие дни отслеживали динамику образования клеточного слоя вокруг сфероидов по фотоснимкам, проводимым на 2, 7, 14, 21 и 28 -ой день 2D культивирования сфероидов. По достижении конфлюэнтности клеточного слоя или в случае ее отсутствия, на 28 день 2D культивирования замену питательной среды прекращали, вызывая постепенную деградацию клеточного слоя.

    В качестве контроля образцы тех же 11 клеточных культур, что использовались для получения сфероидов, переносили в лунки культуральных планшетов в виде суспензии в количестве 5*106 клеток РПЭ в одну лунку (11 лунок), инкубировали в стандартных условиях с питательной средой, которую заменяли каждые 3-4 дня. По достижении конфлюэнтности клеточного слоя или, в случае ее отсутствия, на 28 день 2D культивирования замену питательной среды прекращали, вызывая постепенную деградацию клеточного слоя.

    5 этап. Изучение адгезивных свойств сфероидов ретинального пигментного эпителия в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса in vitro. Моделировали процесс трансплантации сфероидов РПЭ in vitro – пигментный эпителий от донора моложе 50 лет («донор») трансплантировали на мембрану Бруха донора старше 50 лет («реципиент») в условиях органной культуры in vitro. Для этого из каждой из 11 ранее использовавшихся 2D культур РПЭ формировали по 9 сфероидов РПЭ посевного количества 1000 клеток на висячую каплю, культивированных в течение 7 суток в 3D условиях (всего 99 сфероидов). Все сфероиды имели «гладкую» морфологию и средний диаметр 197,0±27,2 мкм.

    Для разработки модели органной культуры хороидально-пигментного комплекса (ХПК) in vitro использовано 9 ГЯДТ; средний возраст донора составил 60,9±4,2 лет; время от момента смерти 8,1±3,2 часов; показатель адреналиновой пробы А.

    Полученные ранее сфероиды переносили на поверхность мембраны Бруха деэпителизированного ХПК и культивировали в стандартных условиях в питательной среде упомянутого ранее состава в течение 7 суток.

    Образцы исследуемого материала фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LВ2 с камерой DFC 320 при х50, х100, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием.
Результаты экспериментальных исследований
     1 этап. Результаты разработки техники выделения клеток РПЭ из ГЯДТ для трансплантации. Разработанная в настоящей работе методика «заднего» доступа отличается от известной тем, что из ГЯДТ последовательно удаляют склеральную оболочку (рис. 1А,B) и хороидально-пигментный комплекс (ХПК) - сосудистую оболочку с прилежащим к ней слоем РПЭ (рис. 1С); после чего с внутренней поверхности ХПК ферментативно и механически извлекают клетки РПЭ в форме суспензии (Патент РФ на изобретение № 2569481). Остаток глазного яблока, включающий радужную оболочку, цилиарное тело, хрусталик, и неповрежденные стекловидное тело и сетчатую оболочку, отделяли единым блоком (рис. 1D).

    Для оценки степени чистоты получаемой суспензии РПЭ образец суспензии объемом 100 мкл исследовали световым микроскопом при увеличении х100 и оценивали в баллах наличие в поле зрения сторонних элементов, помимо клеток РПЭ - фрагментов сетчатки (1 балл), волокон стекловидного тела (1 балл), меланоцитов хороидеи (1 балл). Степени чистоты суспензии РПЭ составили (в баллах): опытная группа, Проба А - 0,3±0,5; контрольная группа, Проба А - 2,3±0,5; опытная группа, Проба B - 0,6±0,5; контрольная группа, Проба В – 2,6±0,5. Была выявлена статистически достоверная разница в чистоте суспензии клеток РПЭ, выделяемой по известной и разработанной методикам (p <0,01, точный критерий Фишера); результат адреналиновой пробы статистически значимого влияния на чистоту получаемой суспензии не оказал (p>0,05, точный критерий Фишера).

    Доля жизнеспособных клеток в выделяемой суспензии составила (в %): опытная группа, Проба А - 85,3±9,2; контрольная группа, Проба А - 80,7±10,9; контрольная группа, Проба В - 80,8±7,9; контрольная группа, Проба В -82,2±7,5. Жизнеспособность клеток во всех группах статистически достоверно не различалась (p>0,05, F-критерий Фишера).

    2 этап. Результаты подготовки ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования. 2D культуры РПЭ пассажей P1 и P6 представляли собой клеточные монослои с конфлюэнтностью 80-90%. Заметным микроскопическим отличием было пониженное содержание внутриклеточного пигмента в культуре более позднего пассажа. Форма клеток в пассаже P1 более приближалась к полигональной (рис. 6), в P6 – к вытянутой. Клетки РПЭ пассажа P6 извлекали из чашки ферментативным способом (смесью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и раствора Версена), подсчитывали в камере Горяева и центрифугировали. Полученный концентрат разбавляли питательной средой упомянутого состава в соотношениях по формулам (1) и (2),

    



где:

    x - объем концентрата (мкл),

    y - объем добавляемой питательной среды (мкл),

    n - планируемое посевное количество клеток в одной висячей капле,

    m - планируемое количество сфероидов,

    v - планируемый объем одной висячей капли (мкл),

    N - фактическое количество клеток в 100 мкл концентрированной суспензии.

    Разбавленную таким образом суспензию наносили на гладкую поверхность крышки чашки RODAC (Replicate Organism Detection And Counting), после чего крышку переворачивали и помещали на соответствующую чашку в положении каплями вниз. На дно чашки наливали дистиллированную воду для поддержания уровня влажности. Инкубировали в стандартных условиях. Питательную среду меняли каждые 3-4 дня.

    Из каждой клеточной 2D культуры (P6) получали по 16 висячих капель различных посевных количеств от каждого донора - по 80 висячих капель от каждого из 11 доноров, по 176 висячих капель каждого из пяти посевных количеств клеток (по 500, 1000, 5000, 25000 и 125000 клеток). Таким образом, было получено 880 трехмерных (3D) культур РПЭ.

    В первые 24 часа 3D культивирования в пространстве каждой висячей капли под действием сил гравитации происходило медленное оседание клеток РПЭ к вершине капли. Параллельно с этим в результате активного клеточного движения и клеточной когезии формировалась неопределенная клеточная масса РПЭ, состоящая из множества мелких агрегатов. К концу 48 часов 3D культивирования формировались первые сфероиды по одному крупному или по несколько среднего размера в одной висячей капле, которые в дальнейшем сливались в один большой.

     К четвертому дню 3D культивирования во всех висячих каплях наблюдали формирование («сборку») одного большого сфероида, поверхность которого была гладкой и обладала характерным блеском. К концу первой и в течение последующих недель наблюдения у части изначально «гладких» сфероидов на поверхности было замечено появление «бахромы», при этом ни один бахромчатый сфероид не был замечен в обратной трансформации, т.е. не стал «гладким».

    В висячих каплях с меньшими посевными концентрациями клеток наблюдали сфероиды лишь «гладкой» морфологии вплоть до окончания сроков наблюдения. С увеличением посевных количеств клеток на висячую каплю и сроков 3D культивирования вероятность образования «бахромчатых» сфероидов увеличивалась. В таб. 1 представлена динамика изменения процентного количества сфероидов с «бахромчатой» поверхностью. Динамика изменения диаметра сфероидов приведена в таб. 2.

    Сфероиды статистически значимо уменьшались в диаметре к концу первой недели (во всех случаях P <0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества на 4 и 7 сутки 3D культивирования, критерий Стьюдента), и в дальнейшем не претерпевали статистически значимых изменений (P>0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества на 7 и 14, 14 и 21, 21 и 28 сутки, критерий Стьюдента). Уменьшение сфероидов на первой неделе культивирования сопровождалось образованием вокруг них пояса клеточного дебриса.

    При сравнении диаметра «гладких» сфероидов на 7 сутки 3D культивирования с внутренним диаметром витреоретинальных игл оказывается, что наиболее подходящими для имплантации с помощью технологий 25-27 Gauge могут являться сфероиды, сформированные в висячих каплях с посевными концентрациями менее 5000 клеток на висячую каплю.

    Иммуноцитохимическое исследование показало, что культура на этапе P1 представлена небольшими группами клеток эпителиоидной (близкой к гексагональной) формы, включающих большое количество гранул пигмента меланина. Клетки экспрессируют RPE-65, E-кадгерин и ZO-1. Также наблюдается относительно слабая экспрессия виментина (рис. 2.A-D).

    В культуре РПЭ пассажа P6 наблюдается изменение морфологии, клетки теряют полярность. Преобладание взаимодействий типа «клетка-субстрат» обусловливает изменения профиля экспрессии маркеров.

     Экспрессия маркеров RPE65 и E-кадгерина практически не выявляется, ZO-1 снижена. В то же время экспрессия виментина нарастает. Перечисленные наблюдения указывают на прогрессию эпителиально-мезенхимальной трансформации в ряду пассажей клеточной культуры (рис. 2, E-G).

    При иммуноцитохимическом анализе сфероидов к концу 2 суток 3D культивирования в наружных слоях сфероидов выявлялась высокая экспрессия виментина и низкая – E-кадгерина и RPE65; ZO-1 экспрессируется диффузно по всему объему сфероида. Вместе с тем, клетки в составе гладких сфероидов более интенсивно экспрессируют E-кадгерин и менее интенсивно – виментин, по сравнению с клетками бахромчатых сфероидов (рис. 3).

    Уровень экспрессии RPE65 выше в «гладких» сфероидах, культивированных в течение 7 суток, чем в «бахромчатых» сфероидах того же срока культивирования и в «гладких» сфероидах 2 суток культивирования. ZO-1 экспрессируется диффузно по всей толще сфероида. Это позволяет подтвердить ранее полученные данные о том, что процесс эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток, запущенный двухмерным культивированием, может быть обращен при их трехмерном культивировании (Ghaderi S, Soheili ZS, Ahmadieh H с соавт., 2011; Kokkinopoulos I, Shahabi G, Colman A, 2011).

    3 этап. Результаты разработки критериев оценки трансплантабельности сфероидов ретинального пигментного эпителия.

    Данные о жизнеспособности клеток в составе сфероидов представлены на рис. 4.

    Зависимость жизнеспособности клеток в составе сфероидов от сроков 3D культивирования. Сфероиды с большими посевными количествами клеток (25000 и 125000 клеток) статистически значимо (P <0,05, статистический z-критерий) снижали свою жизнеспособность к 28 дню 3D культивирования по сравнению со сфероидами 7 дней 3D культивирования. «Гладкие» сфероиды с меньшими посевными количествами клеток (500, 1000 и 5000 клеток) сохраняли жизнеспособность вплоть до 28 дня 3D культивирования, P>0,05, z-критерий.

    Зависимость жизнеспособности клеток в составе сфероидов от посевных количеств клеток. Клетки РПЭ в составе «гладких» сфероидов с посевными количествами 500 и 1000 клеток статистически достоверно не отличались по жизнеспособности (P>0,05, z-критерий), однако при посевных количествах 5000 клеток и более на висячую каплю наблюдали статистически достоверное ее снижение, P <0,05, z-критерий. У «бахромчатых» сфероидов жизнеспособность достоверно снижалась при посевных количествах 25000 клеток и более, P <0,05, z-критерий.

     Зависимость жизнеспособности клеток в составе сфероидов от их морфологии. Жизнеспособность «бахромчатых» сфероидов была достоверно ниже жизнеспособности «гладких» при низких посевных количествах (500, E-кадгерин Виментин RPE-65 ZO-1 E-кадгерин Виментин RPE-65 ZO-1 E-кадгерин Виментин E-кадгерин Виментин RPE-65 ZO-1 RPE-65 ZO-1 1000, 5000 клеток), P <0,05, z-критерий. В то же время «гладкие» и «бахромчатые» сфероиды высоких посевных количеств статистически достоверных отличий не имели, P>0,05, z-критерий.

    Зависимость жизнеспособности клеток в составе сфероидов от показателей адреналиновой пробы ГЯДТ, послуживших исходными источниками клеточного материала. Достоверных различий между двумя группами сфероидов, отличающимися показателями адреналиновой пробы, выявить не удалось, P>0,05, z-критерий.

    Данные об адгезивных свойствах сфероидов РПЭ представлены на рис. 5. Прикрепление «гладких» сфероидов к поверхности субстрата наблюдали уже в первые сутки 2D культивирования сфероидов. В то же время не было зарегистрировано ни одного случая прикрепления «бахромчатых» сфероидов (P <0,05, точный критерий Фишера). Количество адгезировавших сфероидов не изменялось, начиная со вторых суток 2D-культивирования.

    Зависимость адгезивных свойств сфероидов от сроков их предтранспланционного 3D культивирования. Достоверное снижение адгезивных свойств сфероидов наблюдалось в группах сфероидов с длительными сроками 3D культивирования и при больших посевных количествах клеток (25000 и 125000 клеток), P <0,05, z-критерий. В группах с меньшими посевными количествами клеток на висячую каплю достоверных изменений адгезивных свойств не выявлено (прикрепились все сфероиды, независимо от сроков 3D культивирования), P>0,05, z-критерий.

    Зависимость адгезивных свойств сфероидов от посевных количеств клеток. Достоверно более слабыми адгезивными свойствами обладают сфероиды с большими посевными количествами клеток (25000 и 125000 клеток на висячую каплю), P <0,05, z-критерий. Сфероиды с меньшими посевными количествами (1000 и 5000 клеток) достоверных отличий от сфероидов с наименьшей посевной концентрацией (500 клеток) не имели, P>0,05, z-критерий.

    Статистически достоверной зависимости адгезивных свойств сфероидов от показателей адреналиновой пробы ГЯДТ, явившихся первичным источником клеточного материала, выявлено не было, P>0,05, z-критерий.

     4 этап. Результаты изучения процесса реконструкции клеточного слоя при помощи сфероидов ретинального пигментного эпителия in vitro.

    В первые сутки сфероиды прикреплялись к поверхности дна лунок культуральных планшетов и в течение последующих дней «распластывались» во всех случаях, образуя вокруг изначальной зоны прикрепления слой клеток пигментного эпителия (рис. 6).

    Образуемые слои клеток являлись неоднородными. В центре клеточного слоя находился остаток сфероида («ядро» клеточного слоя). Непосредственно возле «ядра» образовывался пояс многоклеточного РПЭ шириной 50-100 мкм, плавно переходящий в монослой клеток РПЭ. Все три зоны появлялись отчетливо к концу первой недели 2D культивирования сфероидов и выявлялись вплоть до 28 дня. По своей морфологии клетки образуемого периферического монослоя имели пониженное содержание пигмента, однако их форма была близка к гексагональной (рис. 7). В контрольной группе клетки во всех случаях (при сравнении с основной группой - P <0,05, точный критерий Фишера) имели веретенообразную форму. Слой клеток распространялся ограниченно, не достигая края лунки планшета, кроме случаев, когда сфероид смещался близко к краю случайным током жидкости. Распространение клеточных монослоев из двух разных сфероидов останавливалось на стыке их фронтов, наползания слоев друг на друга ни в одном случае не наблюдали.

    После прекращения замены питательной среды на 28 сутки наблюдали постепенное сокращение площади, сморщивание и отслоение клеточной культуры. Ни один сгусток клеток не проявил тенденции к распаду на отдельные клетки. В контрольной группе после прекращения смены среды наблюдали распад монослоя на отдельные клетки во всех случаях (P <0,05, точный критерий Фишера).

    Клеточный слой распространялся быстрее в первую неделю после имплантации, выходя затем на фазу плато (рис. 8). Средняя площадь слоя клеток, образуемого вокруг как одиночного сфероида, так и вокруг пары сфероидов РПЭ статистически значимо изменялась в зависимости от времени культивирования (P <0,05, F критерий) – статистически значимо на первой неделе культивирования (P <0,05, критерий Стьюдента) и статистически незначимо в последующих сроках культивирования (P>0,05, критерий Стьюдента).

    5 этап. Результаты изучения адгезивных свойств сфероидов ретинального пигментного эпителия в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса.

     ГЯДТ препарировали по методике, аналогичной разработанной на первом этапе работы – удаляли склеральную оболочку и ХПК (рис. 1А,В,С), после чего фрагмент ХПК размером около 2х2 см помещали в кольцевой зажим-фиксатор клетками РПЭ вверх. Зажим представлял собой крышку-замок отрезанную от стандартной пробирки типа «Эппендорф» (рис. 9) и простерилизованную стандартным методом.

    Открытой к доступу оказывалась подвешенная круглая зона фрагмента размером около 1х1 см Фрагмент ткани образовывал собой дно «микроколодца», сформированного стенками зажима. Каждый зажатый фрагмент помещали в отдельную лунку культурального планшета (Патент РФ на изобретение №2576573). Поверхность ХПК обрабатывали ферментативной смесью 0,25% раствора трипсина и раствора Версена, и механически деэпителизировали шпателем. Поверхность фрагмента промывали от клеток РПЭ и ферментативной смеси стерильным фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) и заливали 2 мл питательной среды (Патент РФ №2578526). На деэпителизированную поверхность переносили сфероиды РПЭ, сконструированные по методике, разработанной на втором этапе и отобранные с максимальными показателями трансплантабельности (третий этап работы) – по одному сфероиду от каждого донора РПЭ на поверхность одного фрагмента ХПК, заливали 2 мл питательной среды и инкубировали в стандартных условиях. Замену среды проводили ежедневно.

    Всего было сформировано по 9 сфероидов от каждого из 11 доноров моложе 50 лет (всего 99 сфероидов) и по одной органной культуре от каждого из 9 доноров ХПК старше 50 лет (всего 9 органных культур).

    В качестве контроля сфероиды РПЭ, сконструированные аналогично опытной группе (99 сфероидов «гладкой» морфологии на 7 сутки 3D культивирования со средним диаметром 203,0±26,5 мкм), переносили на внутреннюю поверхность фрагмента склеральной оболочки размером 2х2 см, с зачищенной бурой пластинкой по одному сфероиду на один фрагмент склеры.

     На рис. 10 представлена исходная картина расположения сфероидов РПЭ сразу после их трансплантации на поверхность мембраны Бруха экспланта ХПК. Рис. 10.А - виден край зажима-фиксатора, вдоль которого располагается полоса неудаленного нативного РПЭ. Рядом – группа сфероидов. Рис. 10.В – при большем увеличении видны 11 сфероидов с четкими очертаниями. На третьи сутки органного культивирования отмечали начало распространения клеточного слоя вокруг сфероидов (рис. 10.С,D) – видны те же 11 сфероидов РПЭ, что и на рис. 10.A,B, но уже с размытыми контурами – вокруг них появляется слой клеток. Сфероиды расположены в тех же позициях, что и в день трансплантации.

    На рис. 11.А. показан сфероид РПЭ под большим увеличением на фоне мембраны Бруха с редкими остаточными клетками нативного РПЭ. Спустя трое суток культивирования он адгезировал к субстрату, в центре видно сгущение клеток и распространяющийся слой клеток РПЭ вокруг. Клетки, исходящие из сфероида, отличаются от клеток нативного РПЭ отсутствием пигментации, однако имеют сопоставимые с ними размеры и форму.

    Морфологическое исследование на 3 сутки органного культивирования подтвердило факт адгезии сфероидов (рис. 12). Между двумя слоями склеральной оболочки находилась фиксированная собственно сосудистая оболочка, к мембране Бруха которой прикрепен сфероид с пигментированными клетками внутри.

    Всего из 99 трансплантированных сфероидов адгезии подверглись 71 (71,7%). 20 сфероидов не прикрепились (20,2%) и 8 сфероидов не были обнаружены после трансплантации в силу технических погрешностей (8,1%).

    В контрольной группе ни один сфероид РПЭ не прикрепился к склеральной оболочке в течение 7 суток наблюдения (100%), ни один сфероид не был технически потерян (разница между контрольной и опытной группами статистически достоверна, P <0,05, точный критерий Фишера).

    Таким образом, в исходе работы была разработана методика выделения аллогенного РПЭ из ГЯДТ с минимальным загрязнением получаемой суспензии сторонними пролиферативно-активными элементами; была разработана техника 3D-культивирования, позволяющая подготавливать аллогенный РПЭ к трансплантации в форме многоклеточных сфероидных микроагрегатов с различными параметрами морфологии и размеров; разработана методика прогнозирования трансплантабельности получаемых сфероидов РПЭ; изучен процесс реконструкции слоя РПЭ при помощи сфероидов in vitro; изучены адгезивные свойства сфероидов РПЭ в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса in vitro.

Выводы

    1. Установлено, что разработанная методика выделения ретинального пигментного эпителия из глаза донора-трупа позволяет получать суспензию с пониженным уровнем загрязнения сторонними клеточными и тканевыми элементами по сравнению с известной методикой (P <0,05).

    2. Показано, что разработанная техника трехмерного культивирования, позволяет подготавливать РПЭ к трансплантации в форме многоклеточных сфероидных микроагрегатов с различными параметрами морфологии и размеров; по размеру наиболее подходящими для имплантации с помощью технологий 25-27 Gauge могут являться сфероиды, сформированные в висячих каплях с посевными концентрациями менее 5000 клеток на висячую каплю.

    3. Показано, что разработанная методика прогнозирования трансплантабельности получаемых сфероидов по параметрам 3D культивирования и внешней морфологии позволяет отбирать сфероиды со статистически достоверно наиболее высокими показателями приживления (P <0,05) – рекомендуются исходные посевные концентрации 500-1000 клеток РПЭ на висячую каплю, сроки 3D-культивирования 7-14 суток, предпочтение следует отдавать сфероидам «гладкой» морфологии.

    4. С помощью методов морфологических исследований показано, что двухмерное культивирование сфероидных микроагрегатов на плоскости культурального пластика вызывает центробежное распространение слоя пигментного эпителия с образованием клеточного монослоя на периферии спустя 7-10 дней культивирования; при этом образуемый монослой клеток на периферии по своим морфологическим признакам статистически значимо отличается от РПЭ, культивированного в 2D условиях, и приближен к нативному РПЭ (P <0,05).

    5. Установлено, что сфероиды РПЭ «гладкой» морфологии, сформированные при посевном количестве 1000 клеток на висячую каплю, культивированные в 3D условиях в течение 7 суток, обладают избирательными адгезивными свойствами по отношению к аллогенной мембране Бруха в органной культуре хороидально-пигментного комплекса (P <0,05).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Борзенок С.А., Попов И.А., Островский Д.С., Сабурина И.Н., Кошелева А.В., Зурина И.М. Конструирование трансплантатов донорского ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования // Бюллетень СО РАМН. – Новосибирск, 2014. - №3 (34), С. 42-47.

    2. Борзенок С.А., Попов И.А., Сабурина И.Н., Кошелева А.В., Зурина И.М. 3D-культивирование ретинального пигментного эпителия трупных донорских глаз человека на предтрансплантационном этапе // VII Всероссийский съезд трансплантологов. Материалы съезда. – М., 2014. – С. 262-263.

    3. Попов И.А., Островский Д.С., Кошелева А.В., Зурина И.М., Сабурина И.Н., Борзенок С.А. Разработка технологии предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации // Актуальные проблемы офтальмологии. IX Всероссийская научная конференция молодых ученых с международным участием. Сборник научных работ под ред. проф. Б.Э. Малюгина. – М., 2014. – С. 163-165.

    4. Попов И.А., Островский Д.С., Кошелева А.В., Зурина И.М., Сабурина И.Н., Борзенок С.А. Разработка технологии предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации. // IX Всероссийская научная конференция молодых ученых с международным участием. Сборник научных работ под ред. проф. Б.Э. Малюгина. – М., 2014. – С. 163-165.

    5. Борзенок С.А., Попов И.А., Островский Д.С., Сабурина И.Н., Кошелева А.В., Зурина И.М. Подготовка аллогенного ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования // VII Российский общенациональный офтальмологический форум. Сборник научных трудов научно-практической конференции с международным участием. Под ред. В.В. Нероева. – М., 2014. - C. 410-414.

    6. Попов И.А., Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Островский Д.С. Реконструкция слоя пигментного эпителия сетчатки при помощи многоклеточных сфероидных микроагрегатов in vitro // X Съезд офтальмологов России. Научные материалы. – М., 2015. – С. 196-197.

    7. Борзенок С.А., Попов И.А., Сабурина И.Н., Арбуханова П.М. Изучение in vitro возможности трансплантации многоклеточных сфероидных микроагрегатов донорского ретинального пигментного эпителия // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2015. – №3. – С. 58-64.

    8. Ilya A. Popov, Sergey A. Borzenok, Irina N. Saburina, Patimat M. Arbukhanova, Dmitriy Ostrovskiy. Reconstruction of the Retinal Pigment Epithelium Cell Layer with Donor Cell Spheroid Microaggregates: Preclinical Study // ARVO 2015. Programme Summary. – Denver, CO, 2015. – P. 40.

    9. Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Попов И.А., Арбуханова П.М., Островский Д.С., Прытова Е.Б. Способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия из глаза взрослого донора-трупа // Патент РФ на изобретение №2569481, приоритет от 25 декабря 2014 г.; зарегистрировано 28 октября 2015 г.

    10. Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Попов И.А., Арбуханова П.М., Островский Д.С., Прытова Е.Б. Способ получения органной культуры собственно сосудистой оболочки из глаза взрослого донора-трупа // Патент РФ на изобретение №2576573, приоритет от 25 декабря 2014 г., зарегистрировано 08 февраля 2016 г.

    11. Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Попов И.А., Арбуханова П.М., Островский Д.С., Прытова Е.Б. Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа // Патент РФ на изобретение №258526, приоритет от 25 декабря 2014 г., зарегистрировано 25 февраля 2016 г.
Биографические данные
    Попов Илья Андреевич - родился в 1987 г. в Москве. В 2010 г. окончил лечебный факультет ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова» (г. Москва) по специальности «Лечебное дело».

    С 2010 по 2012 гг. проходил обучение в клинической ординатуре по специальности «Офтальмология» в ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (г. Москва).

    С 2012 по 2015 гг. обучался в очной аспирантуре по специальности «Глазные болезни» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (г. Москва) в Центре фундаментальной офтальмологии под руководством доктора медицинских наук профессора С.А. Борзенка.

    В 2014 г. стал победителем научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» в секции «Фундаментальная, экспериментальная и эпидемиологическая офтальмология» (МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва).

    С 2015 г. является действительным членом международной Ассоциации по научным исследованиям в области зрения и офтальмологии (The Association for Research in Vision and Ophthalmology).

Список сокращений

    ГЯДТ - глазное яблоко донора-трупа

    ЦМБП - Центр фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем

    РПЭ - ретинальный пигментный эпителий

    ХПК - хороидально-пигментный комплекс

    FITC - англ. fluorescein isothiocyanate, флуоресцеина изотиоцианат

    2D - англ. two-dimensional, двухмерный

    3D - англ. three-dimensional, трехмерный

    DMEM/F12 - англ. Dulbecco’s Modified Eagle Medium / Ham’s F12, смесь питательных сред – среды Игла в модификации Дульбекко исреды Хэма F12 в соотношении 1:1


Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:29:42, Дата изменения: 01.12.2018 12:29:43

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)

XVII Всероссийская школа офтальмологаXVII Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018 ХVI Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научн...

 ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества

Сателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Росс...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Эндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференцияЭндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенациональн...

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Рейтинг@Mail.ru


Open Archives