Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Влияние стволовых/прогениторных клеток на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell


1Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
2МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
3Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук
4Московский государственный университет им. М . В . Ломоносова
5Институт биологии гена Российской академии наук
6Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук

Пигментный ретинит наследственное заболевание, характеризующееся поражением пигментного эпителия и фоторецепторов. Первичное звено патологического процесса палочковые фоторецепторы, отвечающие за периферическое, ночное, сумеречное зрение. По мере прогрессирования заболевания возможно включение в патологический процесс колбочковой системы [2[. Пигментный ретинит является наиболее распространенной причиной наследуемой слепоты. По данным разных авторов, распространенность в популяции составляет 1 случай на 3-5 тысяч человек [1].
Крысы линии Campbell — экспериментальная модель животного с пигментной дегенерацией сетчатки. Существует множество экспериментальных моделей животных с пигментной дегенерацией сетчатки, в том числе линии собак, кошек, кур, свиней, мышей и крыс. Разнообразие моделей связано с разнообразием генетических форм заболевания [3, 4, 7].
Существующие методы лечения этой патологии на сегодняшний день недостаточно эффективны и требуют поиска новых подходов [6, 8].
Дальнейшие перспективы лечения заболеваний сетчатки с использованием клеточных технологий во многом обусловлены активным изучением стволовых клеток. Целью трансплантаций стволовых клеток является: стимуляция собственных стволовых клеток организма и усиление репаративной регенерации. Будучи трансплантированными, стволовые клетки способны встраиваться и дифференцироваться в зависимости от микроокружения [5, 6, 8].
Для того чтобы оценить перспективы и возможность применения стволовых клеток в клинической офтальмологии, необходимо проведение детальных и глубоких экспериментальных исследований, направленных на изучение их влияния на состояние сетчатки.
Цель работы изучить влияние различных типов стволовых/прогениторных клеток (ретинального пигментного эпителия, нейрональных стволовых клеток и клеток цилиарного тела) при супрахориоидальном способе их введения на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell.

Материал и методы
Работа проводилась на 38 крысах (76 глаз) линии Campbell.
1-я часть работы включала изучение морфофункционального состояния
сетчатки у крыс линии Campbell в период постнатального развития, использовано 8 животных (16 глаз).
2-я часть работы включала изучение влияния различных типов стволовых/прогениторных клеток на морфофункциональное состояние сетчатки у крыс линии Campbell, использовано 30 животных (60 глаз). Это исследование включало 3 серии экспериментов, в которых в опытный глаз супрахориоидально вводили различные типы клеток в количестве 300 000 в 2 мкл среды (что является эффективной дозой для выбранного нами способа введения, которая была определена в серии предварительных исследований).
В первой серии эксперимента, включавшей 12 животных, вводили фетальные клетки пигментного эпителия.
Во второй серии, включавшей 8 животных, вводили нейрональные клетки.
В третьей серии эксперимента, включавшей 10 животных, вводили клетки цилиарного тела.
В контрольный глаз вводился такой же объем сбалансированного физиологического раствора.
Перед началом введения клеточного материала всем животным давали наркоз. Методика проведения наркоза предварительно была отработана на нелинейных крысах в возрасте 25-30 дней, затем адаптирована по отношению к животным линии Campbell.
Для безопасного супрахориоидального введения клеточного материала и обеспечения точности его дозирования было использовано специальное оборудование штатив для фиксации животного и система для введения материала, которая состояла из шприца «Hamilton» (серия 750LT), иглы калибра 29G и канюли для супрахориоидального введения; шприц фиксировался в установке с микровинтом, позволяющим медленно и точно вводить необходимый объем клеточного материала. Голову животного фиксировали за основание носа так, что при необходимости было возможно осуществить ее поворот в ту или иную сторону. Специальные распорки, расположенные на штативе для фиксации, служили векорасширителями. На конъюнктиву накладывали два параллельных шва-держалки, обеспечивающих доступ к зоне инъекции и стабилизацию глазного яблока. Производили разрез конъюнктивы между швами. Иглой делали косой надрез склеры, в который помещалась канюля для супрахориоидального введения. Постепенно вращая микровинт и обеспечивая тем самым введение клеточной суспензии, медленно продвигали канюлю по направлению к зрительному нерву (рис. 1). Когда суспензия заканчивалась, канюлю медленно извлекали, вводя небольшое количество воздуха. Он не позволял введенной клеточной массе выйти под давлением через склеральный разрез. Благодаря косому входу края склерального разреза плотно смыкались, что не требовало наложения шва. После удаления швов-держалок накладывали швы на конъюнктиву 10:0. Производили инстилляции витабакта и индоколлира и подкожные инъекции дексазона.
Электроретинография
Регистрация ЭРГ производилась с помощью роговичного контактного электрода; референтный электрод при этом размещался подкожно на загривке у животного. Для количественной оценки интенсивности ответа производился анализ максимальной амплитуды b-волны ЭРГ. Другие компоненты ЭРГ (a-волна и off-ответ) в исследовании не учитывались в связи с тем, что, во-первых, они слабо выражены у данных экспериментальных животных и, во-вторых, при развитии дегенеративных изменений в сетчатке в постнатальном периоде у этих животных наблюдается пропорциональное уменьшение волн ЭРГ.
Морфологический анализ
Срезы толщиной 20 мкм изготавливались на криотоме, монтировались на предметном стекле и окрашивались иммуногистохимически на рековерин; в качестве фонового окрашивания использовалась окраска ядер с помощью бисбензимида. Измерение толщины наружного ядерного слоя (ONL-outer nuclear layer) проводилось на флуоресцентных микрофотографиях окрашенных срезов, сделанных в свете флуоресценции бисбензимида. Параллельные микрофотографии в свете флуоресценции рековерина использовались для верификации границ наружного ядерного слоя при сильной степени дегенерации.

Результаты и обсуждение
При исследовании срезов сетчатки животных линии Campbell было выявлено, что уже на 25-й день постнатального периода в наружном ядерном слое развиваются дегенеративные изменения появляются очаги дегенерации, не содержащие живых клеток (пустоты), толщина слоя уменьшается на 20-30% (рис. 2, 3), к 34-м суткам более чем на 50% (рис. 4), к 60-м на 80-90% и теряет свою непрерывность (рис. 5).
На основании полученных данных был определен оптимальный срок для введения клеточного материала 19-20-й день жизни животного (глаза открываются к концу второй недели).
По данным электроретинографии, на 34-й день постнатального развития амплитуда b-волны в опыте при введении клеток пигментного эпителия составляла в среднем 36,6% от нормы, при введнии нейрональных клеток 12,3% и при введении клеток цилиарного тела 7,6%.
Средняя амплитуда b-волны ЭРГ на контрольных глазах составляла при введении клеток пигментного эпителия 20,7% , нейрональных клеток - 6,75%, клеток цилиарного тела 7,3% (рис. 6).
Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе их введения оказывают достаточно выраженное положительное влияние на функциональное состояние сетчатки животных в возрасте 34 дней.
По результатам морфологических исследований, на 34-й день постнатального развития в опыте средняя толщина наружного ядерного слоя при введении клеток ретинального пигментного эпителия составила 31,6 мкм, при введении нейрональных клеток 29,7 мкм, при введении клеток цилиарного тела 26,2 мкм.
В контроле в парных глазах: при введении клеток ретинального пигментного эпителия толщина наружного ядерного слоя составила 29,6 мкм, при введении нейрональных клеток 25,5 мкм, при введении клеток цилиарного тела 24,7 мкм (рис. 7, 9)
Таким образом, клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе введения оказывают выраженное стабилизирующее влияние на процессы, развивающиеся в наружном ядерном слое сетчатки крыс линии Campbell.

Заключение
Установлено, что нейрональные клетки и клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе их введения на 19-й день постнатального развития в количестве 300 000 клеток в 2 мкл среды оказывают выраженное положительное влияние на функциональное состояние сетчатки крыс линии Campbell к 34-му дню постнатального развития, причем клетки пигментного эпителия оказывают более выраженный эффект. Клетки цилиарного тела оказывают слабоположительное влияние.
На основании результатов морфологического исследования толщины наружного ядерного слоя сетчатки крыс линии Campbell установлено, что все три типа стволовых/прогениторных клеток оказывают стабилизирующее влияние на процессы дегенерации сетчатки. Наиболее выраженный эффект проявляется при введении клеток ретинального пигментного эпителия, а наименее выраженный — при введении клеток цилиарного тела.
Выявлено, что введение стволовых/прогениторных клеток в супрахориоидальное пространство опытного глаза замедляет развитие процессов дегенерации парного глаза, что, возможно, связано со стимуляцией продукции факторов роста и активацией эндогенных стволовых клеток.
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru