Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.735-073

Вызванные видимым светом изменения спектров флуоресценции флуорофоров липофусцновых гранул, полученных из ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека


1Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук
2МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ


    Регистрация in vivo аутофлуоресценции глазного дна человека — новый неинвазивный метод диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки. Аутофлуоресценция позволяет оценить состояние, сохранность и жизнеспособность комплекса «ретинальный пигментный эпителий (РПЭ)⁄фоторецепторы». Одним из основных источников аутофлуоресценции глазного дна являются ЛГ в клетках РПЭ [17].
    ЛГ обладают не только сильной флуоресценцией. Как нами было показано в начале 90-х годов, ЛГ фотохимически активны: при действии видимого света они способны образовывать активные формы кислорода [5, 10]. В настоящее время накоплена большая литература о фототоксичности и патогенетической роли ЛГ [4, 11].
    Считается, что основным флуорофором ЛГ, ответственным за регистрируемую в настоящее время аутофлуоресценцию глазного дна, является т.н. А2Е (N-ретинил-N-ретинилиденэтаноламин) — продукт взаимодействия двух молекул полностью-транс-ретиналя с аминогруппами одного из липидов фоторецепторной мембраны — фосфатидилэтаноламина [9, 15]. Помимо А2Е, ЛГ содержат еще около десятка других ретиналь-содержащих флуорофоров [13].
    В присутствии кислорода А2Е фотоокисляется с образованием различных окисленных форм [7, 12]. Окисленные продукты А2Е способны оказывать токсическое действие на клеточные структуры уже без участия света [18]. Будучи более гидрофильными, чем исходный А2Е [6], они могут высвобождаться из ЛГ и перемещаться в цитоплазме в другие клеточные органеллы клетки РПЭ [2].
    Окисленные формы А2Е были обнаружены в ЛГ, выделенных из старческих глаз человека и из РПЭ глаз мышей с мутацией в ABCR гене, моделирующем болезнь Штаргарда [8, 16]. При этом, с помощью метода ВЭЖХ были идентифицированы в РПЭ как мышей, так и человека обе формы продуктов окисления А2Е – эпокси и фурано производные [14].
    Вполне вероятно, что в развитии дегенеративных процессов в сетчатке и РПЭ важную роль могут играть как А2Е и другие флуорофоры, так и продукты их фотоокисления.
    Важно подчеркнуть, что образование и накопление таких продуктов должно отражаться на спектральных характеристиках картины аутофлуоресценции глазного дна. Действительно, ранее уже было показано, что при действии света меняются спектры поглощения и флуоресценции как А2Е, так и самих ЛГ как следствие их фотоокисления [1-3].
    Поэтому для повышения информативности этого нового неинвазивного метода диагностики — аутофлуоресценции глазного дна, важно исследовать, как именно при действии света в видимой области спектра и в ходе старческих изменений меняются флуоресцентные свойства ЛГ и их основного флуорофора А2Е.
    Цель работы — исследование изменения флуоресцентных свойств ЛГ и их основного флуорофора А2Е при действии света в видимой области спектра и в ходе старческих изменений.

Материал и методы
    В работе использовались реактивы производства «Sigma», «SigmaAldrich», «Fluka», «Компонент-реактив», пластиковые одноразовые пробирки на 1 мл и одноразовые пипетки производства «Eppendorf». Для ВЭЖХ использовались растворители производства «Sigma», «Fluka» хроматографической чистоты.
    Этапы работы
    1. Выделение липофусциновых гранул
    Гранулы были выделены из РПЭ сетчатки глаз доноров возраста 17-70 лет. Глаза трупов-доноров без каких-либо офтальмологических патологий после выделения роговицы для трансплантации передавались для исследований из Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Все этапы выделения проводили в приглушенном свете.
    Липофусциновые гранулы выделялись и подвергались очистке с помощью методов, описанных в работе [8]. Образцы содержали ?2*107 гранул на 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH = 7,3).
    В экспериментах по изучению относительного содержания окисленных форм флуорофоров в различных возрастных группах образцы ЛГ были получены из 50-53 глаз трупов-доноров 1-й возрастной группы (17-40 лет) и из 45-47 глаз — для 2-й возрастной группы (40-70 лет). В экспериментах по изучению относительного содержания окисленных форм флуорофоров при облучении ЛГ видимым светом образцы ЛГ были получены из 60 глаз трупов-доноров без выделения возрастных групп.
    2. Синтез N-ретинилиден-Nретинилэтаноламина (А2Е)
    А2Е синтезировали и очищали с помощью методов, описанных в работе [6]. Чистоту А2Е контролировали методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия).
    3. Получение липофусцинового экстракта.
    К суспензии ЛГ в фосфатном буфере добавляли двукратный избыток смеси хлороформ: метанол (2:1), перемешивали на электрической мешалке 2 мин и затем инкубировали при температуре 4 С° 10 мин. Смесь центрифугировали на центрифуге «MLW K 26 D» (680 g, 10 мин., 4 С°). Нижнюю хлороформную фазу отбирали шприцом и переносили в колбу. Полученный хлороформный экстракт упаривали с помощью водоструйного насоса. К полученному осадку добавляли 200 мкл метанола для дальнейшего хроматографического анализа.
    4. Облучение образцов
    Для облучения образцов была использована лампа накаливания «КГМ 24-150» мощностью 150 Вт, оптическая система слайдпроектора с тепловым фильтром. Облучение образцов осуществляли полным видимым светом в диапазоне 390-700 нм при постоянном перемешивании.
    5. Регистрация спектров поглощения и флуоресценции
    Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV-1700» (Япония).
    Спектры флуоресценции регистрировали на флуориметре «Shimadzu RF-5301PC» (Япония). Из-за невозможности точной корреляции концентрационной зависимости продуктов фотоокисления с начальными условиями реакции все спектры флуоресценции были нормализованы по максимальному значению флуоресценции. Анализ проводили по изменению положения максимумов флуоресценции.
    6. Высокоэффективная жидкостная хроматография
    Хроматографическое разделение производных полностью-транс-ретиналя и других полиенов проводили на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия) с использованием колонки «Диасфер 120 С18» (4*120 мм, размер сорбента — 5 мкм). Разделение проводилось путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% трифторуксусной кислоты) до 100% ацетонитрила за 20 мин; скорость потока – 1,5 мл⁄мин. Измерения проводили при длине волны 430 нм с помощью спектрофотометрического детектора «Knauer К-2501».

Результаты и обсуждение
    1. Изменение спектров поглощения ЛГ и синтетического А2Е при облучении их видимым светом
    Суспензия ЛГ в фосфатном буфере, а также раствор синтетического А2Е в метаноле были подвергнуты интенсивному облучению в диапазоне 390-700 нм. Были также исследованы спектральные свойства хлороформных экстрактов, полученных из ЛГ до и после их облучения видимым светом.
    На рис. 1 приведены спектры поглощения суспензии ЛГ, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического А2Е до и после облучения.
    Несмотря на то, что в спектре поглощения суспензии ЛГ (рис. 1-1) трудно выделить ярко выраженные максимумы, тем не менее, видно, что поглощение ЛГ в области 430 нм при облучении видимым светом заметно снижается, при этом наблюдается увеличение интенсивности поглощения в области 290 нм.
    Спектр поглощения хлороформного экстракта, полученного из суспензии необлученных ЛГ (рис. 12), демонстрирует более отчетливые максимумы («плечи») в области 270, 330 и 430 нм, по сравнению с самой суспензией ЛГ. После облучения ЛГ поглощение полученного из них хлороформного экстракта в области 340 и 430 нм практически исчезает, а коротковолновый максимум смещается в область 260 нм.
    Спектр поглощения синтетического А2Е (рис. 1-3) имеет максимумы в области 340 и 430 нм. После 2 часов облучения спектр А2Е меняет форму: поглощение в области 340 и 430 нм значительно уменьшается, выраженные максимумы пропадают, при этом появляется новый максимум в ультрафиолетовой области (280 нм).
    Таким образом, при облучении видимым светом как суспензии ЛГ в фосфатном буфере, так и синтетического А2Е в метаноле спектры поглощения исследуемых образцов меняются с одинаковой тенденцией. Другими словами, продукты, поглощающие в области 340-430 нм, при облучении практически исчезают, при этом наблюдается появление других продуктов, поглощающих в ультрафиолетовой области. Эти результаты позволяют рассматривать хлороформный экстракт из ЛГ и синтетический А2Е в метаноле как модельные системы для изучения превращения ЛГ при их облучении видимым светом или в ходе старения.
    2. Изменение флуоресцентных свойств ЛГ и синтетического А2Е до и после их облучения видимым светом
    Флуоресценцию всех образцов возбуждали светом с длинами волн 340 и 430 нм, соответствующих максимумам в спектрах поглощения А2Е — основного флуорофора ЛГ.
    На рис. 2А, Б приведены спектры флуоресценции суспензии ЛГ в фосфатном буфере, хлороформного экстракта из ЛГ и раствора синтетического А2Е в метаноле до и после их облучения.
    При облучении всех образцов видимым светом в спектрах флуоресценции наблюдаются более заметные изменения, чем в спектрах поглощения. Из рис. 2 отчетливо видно, что максимумы всех спектров смещаются в коротковолновую область. В табл. 1 представлены значения максимумов флуоресценции до и после облучения всех образцов.
    Можно предположить, что при облучении образцов практически все содержащиеся в них флуорофоры претерпевают спектральные изменения, а продуктами облучения являются их окисленные формы.
    Следует отметить, что в модельных системах (хлороформный экстракт из ЛГ и синтетический А2Е) продукт с полосой флуоресценции в области 540 нм практически отсутствует (рис. 2, А-2,3), в то время как в самих ЛГ хорошо виден (рис. 2, А-1). Можно предположить, что неэкстрагирующийся в хлороформ флуорофор(ы) является продуктом взаимодействия ретиналя с белком.
    Таким образом, при облучении всех исследуемых образцов максимумы флуоресценции сдвигаются в коротковолновую область на 20-40 нм.
    3. Хроматографический анализ хлороформного экстракта из ЛГ и А2Е в метаноле до и после облучения видимым светом
    Ранее нами и другими авторами было показано, что при облучении А2Е видимым светом образуются его окисленные продукты фураноидной и эпокси-форм [7, 12, 14, 16].
    В данной работе нами был проведен сравнительный анализ ВЭЖХ хлороформных экстрактов из ЛГ и синтетического А2Е до и после облучения (рис. 3).
    Как можно видеть из рис. 3, при облучении А2Е в метаноле на хроматограмме наблюдается появление 2 новых пиков — окисленных форм А2Е (рис. 3А, пики Oxy-A2E) [7]. Одновременно с образованием этих новых продуктов наблюдается снижение количества самого А2Е. Следует отметить, что, помимо этих идентифицированных окисленных форм, на хроматограмме видно появление новых продуктов, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его оксиформами (рис. 3А, группы пиков 1 и 2).
    Аналогичные результаты были получены и при хроматографическом анализе хлороформных экстрактов из ЛГ до и после их облучения видимым светом (рис. 3 Б). Из рисунка видно, что, как и в случае А2Е, при облучении ЛГ на хроматограмме также наблюдается появление 2 новых пиков — окисленных форм А2Е (рис. 3Б, пики Oxy-A2E), при этом наблюдается снижение количества самого А2Е (рис. 3Б, пики 6-8). Также, помимо этих идентифицированных окисленных форм, видно увеличение интенсивности полос на хроматограмме, соответствующих продуктам, которые имеют более короткие времена удерживания по сравнению с А2Е и его оксиформами (рис. 3Б, группы пиков 1 и 2). Следует подчеркнуть, что времена удерживания новообразующихся продуктов окисления как в облученном А2Е в метаноле, так и в хлороформных экстрактах из облученных ЛГ находятся в хорошем соответствии. Это может свидетельствовать о том, что А2Е как в метаноле, так и в составе ЛГ окисляется с образованием продуктов с идентичными свойствами, в том числе спектральными.
    4. Зависимость относительного содержания различных флуорофоров в ЛГ от возраста доноров кадаверных глаз без видимых зрительных патологий
    Был проведен сравнительный ВЭЖХ-анализ относительного содержания разных флуорофоров⁄групп флуорофоров в ЛГ, выделенных из глаз доноров-трупов разных возрастных групп. Отсутствие видимой зрительной патологии и следов перенесенных офтальмохирургических операций верифицировалось врачами-офтальмологами Глазного тканевого банка ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Возрастной интервал 1-й группы составлял 17-40 лет, 2-й группы — 40-70 лет.
    Из результатов ВЭЖХ-анализа хлороформного экстракта из ЛГ до и после облучения (рис. 3Б, табл. 2) видно, что относительное содержание основных изомерных форм А2Е (пики 6-8) до облучения в сумме составляло около 47%, после облучения — около 41%. Другими словами, относительное содержание окисленных форм А2Е и, возможно, других флуорофоров после облучения увеличилось. Анализ хлороформных экстрактов из необлученных ЛГ, полученных от разных возрастных групп, также дал аналогичный результат. В 1-й группе (17-40 лет) относительное содержание изомерных форм А2Е составляло в среднем около 52%, в то время как в 2-й группе (40-70 лет) — около 47%. Таким образом, с возрастом соотношение между неокисленным А2Е и его окисленными формами меняется в сторону увеличения последних. Следует отметить, что данный эксперимент проводили с трупным донорским материалом без видимых патологических состояний и с незначительной разницей в возрасте по группам сравнения. В настоящее время нами проводится аналогичный эксперимент, но с большей возрастной разницей по группам сравнения (20-30 лет и 60-70 лет соответственно), а также с трупным донорским материалом, имеющим различную офтальмологическую патологию.
    Таким образом, в данной работе было показано, что флуорофоры ЛГ подвергаются фотоокислению при облучении видимым светом, в результате чего происходит изменение их флуоресцентных характеристик: максимумы спектров флуоресценции сдвигаются в коротковолновую область на 25-40 нм. При этом суммарное относительное содержание окисленных форм флуорофоров увеличивается с 48 до 53% (табл. 2).
    Способность окисленных форм флуорофоров к генерации активных форм кислорода снижается в условиях in vivo в основном за счет хрусталика, отсекающего от сетчатки и РПЭ ультрафиолетовый свет, а с увеличением возраста — и, частично, синюю часть спектра. Тем не менее, уже образованные окисленные формы флуорофоров могут оказывать токсическое действие даже в отсутствии света [18]. Поэтому представляется важным знать количественное соотношение неокисленных и окисленных форм флуорофоров в ЛГ в зависимости от возраста и различной глазной патологии.
    В настоящее время для возбуждения аутофлуоресценции глазного дна, как правило, используется импульсное излучение аргонового лазера с длиной волны 488 нм и детекцией флуоресценции в области 500-600 нм [17], но, очевидно, что бo? льшая часть информации по флуоресценции теряется при этом. Вместе с тем в области 500-540 нм можно было бы определить описанную в данной работе разность флуоресцентных свойств. Соотношение интенсивности флуоресценции на длинах волн 540 и 500 нм при ее возбуждении длиной волны 488 нм могло бы дать полезную информацию при диагностике целого ряда патологических состояний с разными степенями выраженности и активности. В данной работе мы приводим подобные характеристики, полученные для статистически нормального состояния глазного дна людей молодого и трудоспособного возраста.

Вывод
    Для повышения информативности нового неинвазивного метода диагностики — аутофлуоресценции глазного дна — представляется важным определение соотношения неокисленных и окисленных форм флуорофоров в ЛГ в зависимости от возраста и различной глазной патологии.
    Работа была поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» и грантом РФФИ № 08-04-12132.
    Поступила 14.04.09

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru