Online трансляция


Научно-практическая конференция с международным участием
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Москва. Гостиница Holiday Inn Sokolniki
4 февраля 2017 г.



15-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Сочи, 16-17 марта 2017
Официальный сайт

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 22 2016
№ 21 2016
№ 20 2015
№ 19 2015
№ 18 2015
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
№ 2 (28) Апрель 2016
№ 1 (27) Март 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.735

Сравнительная харктеристика влияния фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки


1Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
2МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
3Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук
4Институт биологии гена Российской академии наук

    В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки, приводящая к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей.
    Несмотря на различие этиологических факторов в основе развития целого ряда патологий сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая и посттромботическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и т.д., лежат процессы патологического ангиогенеза, которые развиваются в результате дисбаланса между про-ангиогенными (VEGF — сосудисто-эндотелиальный фактор роста, FGF – фактор роста фибробластов, ангиогенин, интерлейкин 8) и антиангиогенными (ангиостатин, эндостатин, PEDF — фактор пигментного эпителия, PF4 — фактор тромбоцитов 4) факторами.
    На сегодняшний день перспективы проведения коррекции аномального ангиогенеза связаны, в основном, с группой препаратов (Луцентис, Авастин), являющихся блокаторами ангиогенного стимулятора — сосудисто-эндотелиального фактора роста — VEGF, т.е. только одного из звеньев антогонистической системы.
    Для достижения же необходимого эффекта, в такой системе необходимо наличие динамического баланса. Одним из представителей наиболее активных ингибиторов ангиогенеза является фактор пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor – PEDF) [3, 4, 6].
    PEDF — белок с молекулярной массой 50 килоДальтон, относится к классу серпинов, ингибиторов сериновых протеаз [8, 9]. Синтезируется в клетках пигментного эпителия сетчатки [11], содержится в высоких концентрациях в интерфоторецепторном матриксе и стекловидном теле, в более низких — в роговице, хрусталике и внутриглазной жидкости [9, 10, 11].
    Безусловный интерес PEDF представляет еще и в связи с тем, что он обладает нейротрофическим действием. Он поддерживает нормальное развитие фоторецепторов и экспрессию в них зрительного пигмента после гибели пигментного эпителия сетчатки [5], оказывает нейропротективное действие на фоторецепторы сетчатки при световом [2] и глутаматном повреждении [7], обладает способностью поддерживать выживание ретинальных нейронов после вызванной перекисью водорода гибели клеток in vitro [1].
    Однако для того, чтобы оценить перспективы и возможность применения этого фактора в клинической офтальмологии, необходимо проведение дальнейших экспериментальных исследований, направленных на изучение влияния PEDF на состояние сетчатки. В настоящее время в качестве экспериментальных моделей ряда патологий широко используются различные типы клеточных и тканевых культур. Наиболее перспективными для проведения исследований являются органотипические культуры сетчатки, обладающие следующими преимуществами: сохранность цитоархитектоники; отсутствие нейро-гуморальных воздействий; возможность создать модель, максимально соответствующую поставленным задачам.
    Цель работы — изучение влияния рекомбинантного PEDF и Авастина на состояние органотипических культур сетчатки.

Материал и методы
    В работе было использовано 90 эксплантатов сетчатки семидневных крыс: 30 эксплантатов культивировали с PEDF (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестернблот анализа), 30 — культивировали с Авастином (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа), 30 эксплантатов входили в группу контроля (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа).
    Изолированные глаза крыс промывали в 70% этиловом спирте и в двух сменах стерильного фосфатного буфера (DPBS; «Sigma»). Сетчатку выделяли в охлажденном DPBS, содержащем 0,8% глюкозы (G1 — DPBS). Цельную сетчатку промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой (DMEM⁄F12 с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% сыворотки).
    Цельные эксплантаты культивировали в прикрепленном виде в чашке Петри диаметром 30 мм.
    Культивирование проводили в инкубаторе во влажной камере при температуре +37 °С и содержании углекислоты 5% в культуральной среде DMEM⁄F12 (1:1) с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Смену среды производили каждые 2-3 суток.
    PEDF добавляли в среду в концентрации 0,5 μg⁄ml, а Авастин – 50 μg⁄ml. Эффективность этой концентрации была определена предварительно в экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Контролем служили эксплантаты, культивируемые без PEDF и Авастина.
    Культивирование производили в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференном растворе антифриза до окрашивания антителами.
    Во время эксперимента состояние эксплантатов и поведение клеток контролировали ежедневно с помощью микроскопа с фазовым контрастом. Для оценки жизнеспособности клеток эксплантата использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки и пропидий йодистый, который окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток.
    По окончании эксперимента эксплантаты промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% раствором параформальдегида в физиологическом растворе с добавлением 0,01 молярного фосфатного буфера при рН=7,4 в течение 20 минут при 4 °С. После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки просушивали и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммитированных нейробластов — β-III-тубулину в разведении 1:100 (Chemicon, MAB 1637) и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток — кислому глиальному фибриллярному белку — GFAP в разведении 1:80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов при 4 °С. После промывки в фосфатном буфере, эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши, меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении), оба в разведении 1:100.
    Для анализа антиангиогенных свойств был проведен Вестерн-блот анализ. Для этого использовали эксплантаты, культивируемые с PEDF, Авастином и эксплантаты из группы контроля. Метод основывается на определении количества экспрессируемого фактора фон-Виллебранда, который синтезируется в эндотелиальных клетках, являясь внутриклеточным протеином, специфичным для данного типа клеток. Для проведения метода приготавливали клеточные лизаты опытных и контрольных образцов при помощи Reporter Lysis Buffer. После обработки лизирующим раствором чашки помещали в жидкий азот на несколько секунд, а потом в термостат при +37 °С на 10 мин. Полученный лизат центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) с раствором для прокрашивания:
    50 мМ Tris (PH=6,8) .............1 мл
    50% глицерин..........................5 мл
    15% SDS ........................................1,5 мл
    15 β-меркаптоэтанол.........1,5 мл
    0,01% ВРВ....................................1 мл
    Для переноса на мембрану использовали режим переноса 2 мА⁄см² (стабилизация по току) 2 часа и напряжение не более 20В. Затем мембрану окрашивали Ponceau Red 3-5 минут на шейкере, чтобы проконтролировать наличие белка на мембране. Затем отмывали мембрану в буфере TBST 3 раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (anti-von Willibrand Faktor; разведение 1:1000) в 15 мл TBST ночь при +4 °С. Затем мембрану отмывали 15 минут в TBST буфере 2 раза по 10 минут на шейкере. После этого мембрану инкубировали с вторичными антителами (antirabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена; разведение 1:10000) 1,5 мл на 15 мл TBST ночь при +4 °С. Мембрану промывали в 20 мл TBST (15 минут два раза по 10 минут на шейкере). Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare). Правильность нанесения порций белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране. Мембрану инкубировали с первичными антителами (actin c-2; разведение 1:1000) по методике, описанной выше. Затем со вторичными антителами (антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена; в разведении 1:10000) и проявляли по методике, описанной выше.

Результаты и обсуждение
    В течение первых 5-7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. При проведении исследования в фазовом контрасте на данном этапе эксплантаты сетчатки при культивировании с PEDF и Авастином и без них по внешнему виду и по количеству выселившихся на дно клеток не отличались.
    На 14-й день культивирования происходило дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. При исследовании в фазовом контрасте в эксплантатах, культивируемых с PEDF, начинали формироваться многочисленные длинные отростки, выходящие за пределы эксплантатов (рис. 1-2). В контроле и в культурах с Авастином наблюдались глиальные клетки, единичные клетки с морфологией нейронов (рис. 3, 4) и единичные отростки нейронов.
    На 17-е и, особенно, на 21-е сутки культивирования продолжалось выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с PEDF, происходило дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности, происходило формирование новой сети из выселившихся нейронов (рис. 5-6). В контроле и в культурах с Авастином происходило в основном выселение глиальных клеток, наблюдались единичные клетки с морфологией нейронов и единичные отростки нейронов (рис. 7-8).
    На 30-е сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с PEDF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых значительно больше, чем на 21 сутки. В этих эксплантатах было обнаружено большое количество GFAPиммунонегативных — βIII-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть (рис. 9-10). За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии βIII-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле происходило расселение GFAP-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие βIII-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов в небольшом количестве. При этом аксоноподобные βIII-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и очень редко выходили за его пределы, в отличие от опыта (рис. 11-12).
    По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 30-е сутки в эксплантатах, культивируемых без PEDF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели как внутри, так и на поверхности эксплантатов (рис. 13). В эксплантатах, культивируемых с PEDF, очаги клеточной гибели были значительно меньше (рис. 14). Очаги клеточной гибели в культурах, культивируемых с Авастином, были меньше по сравнению с контролем, но больше, чем в культурах с PEDF (рис. 15).
    При проведении Вестерн-блот анализа была установлена идентичная ширина полос тестового белка — актина во всех опытах, что говорит о правильности проведения исследования. Кроме этого, выявлено, что в контроле экспрессия фактора фон-Виллибранда в 2 раза выше, чем при действии PEDF и Авастина, о чем свидетельствует ширина вторых полос на полученных результатах, характеризующих количество исследуемого белка (рис. 16).

Заключение
    Установлено, что по сравнению с Авастином и контролем в органотипических культурах сетчатки крысы при культивировании с PEDF увеличивается жизнеспособность клеток сетчатки; развивается активная клеточная миграция и активный рост βIII-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, выходящих за пределы эксплантата. Можно предположить, что эти тонкие аксоноподобные отростки являются регенирирующими аксонами выживших после эксплантации ганглиозных клеток.
    Выявлено, что в культурах сетчатки, культивируемых с PEDF и Авастином, экспрессия фактора фон-Виллибранда значительно меньше, чем без них. Полученные данные подтверждают наличие у фактора пигментного эпителия выраженных антиангиогенных свойств, которые сопоставимы по степени выраженности с Авастином.
    Таким образом, фактор пигментного эпителия (PEDF) обладает выраженными нейропротективными и нейротрофическими свойствами, а также имеет мощную антиангиогенную активность.
    Поступила 06.11.08
    Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 08-04-00881-а, 07-04-12120-офи, 07-04-00835-а) и Госконтрактом № 02.512.11.2224 от 4 июля 2008 г.
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru