Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

2.1. Материалы и методы экспериментальной части исследования


1----------

    Экспериментальная часть исследования выполнена в Клинике Волгоградского филиала Федерального Государственного Автономного Учреждения «Межотраслевого Научно-технического Комплекса «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также на базе Кафедры неорганической и коллоидной химии и Кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Волгоградского Государственного Медицинского Университета.

    Экспериментальные методы исследования применялись для оценки безопасности модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена (физико – химические и гистологические методы исследования) по степени насыщения роговицы раствором рибофлавина по сравнению со стандартной методикой. Биомикроскопия, а также метод прижизненной оценки морфологии роговицы (оптическая когерентная томография) для оценки эффективности модифицицированной методики кросслинкинга ровичного коллагена.

    2.1.1. Офтальмологическое оборудование и инструменты, применявщиеся в экспериментальной части исследования

     Для поведения хирургических вмешательств использовалось следующее офтальмологическое оборудование:

    1. Лазер эксимерный AMARIS (Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2008/02427, Сертификат соответствия № РОСС DE. АЯ46. А01107, изготовитель «Schwind GmbH& Co.KG», Германия); Для проведения деэпителизации эксимерным лазером использовался режим работы фототерапевтической кератэктомии (ФТК);

    2. Прибор для кросслинкинга роговичного коллагена «UV -X версия 1000» (Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2009/03683, Сертификат соответствия № РОСС СН. ИМ24. В02284, изготовитель «IROC AG», Швейцария);

    3. Векорасширитель М 959. 12Т (Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02713, Сертификат соответствия № РОСС RU. МЕ. 27, изготовитель ООО «Медин-Урал», Россия);

    4. Трепан Franceschetti с поршнем Franceschetti Keratoplasty Trephines с диаметром просечки 9,0 мм (изготовитель ООО «Медин-Урал», Россия);

    5. Глазной фиксатор (изготовитель ООО «Научно-экспериментальной производство «Микрохирургия глаза» ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза», им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ, Россия);

    6. Диафрагмирующая решетка для проведения дозированной точечной эксимерлазерной деэпителизации.

    Устройство «диафрагмирующая решетка» изготовлено ООО «ПСК «Царицын – Паркет» (г. Волгоград, Россия) по заказу Волгоградского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза», им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ на собственном лазерном технологическом оборудовании с использованием систем позиционирования с точностью 10,0 мкм и специализированных источников лазерного излучения с длиной волны 10,6 мкм в режиме ТЕМооq.

    7. Диафрагмирующая решетка для проведения дозированной точечной эксимерлазерной деэпителизации на роговицах экспериментальных животных (кроликов) (изготовитель ООО «ПСК «Царицын – Паркет», Волгоград, Россия)

    8. Пластиковый воронкообразный векорасширитель из комплекта для измерения внутриглазного давления «ГлауТест 60» (Регистрационное удостоверение № ФС 022а2006/3902-06, Сертификат соответствия № РОСС RU. ИМ02. В14210, изготовитель ИП Гуров Андрей Сергеевич, Москва, ОКПО).

    В процессе проведения экспериментальной части работы in vivo использовались следующие виды офтальмологического обследования:

    1. Биомикроскопия на щелевой лампе «Takagi SM-70» (Takagi Seiko Co, Япония);

    2. Оптическая когерентная томография роговицы на когерентном томогрфе Cirrus HD 300 («Carl Zeiss», Германия) с оперделением толщины эпителиального слоя и глубины залегания демаркационной линии.

    Для медикаментозного сопровождения хирургических операций и раннего послеоперационного периода применялись следующие фармакологические препараты:

    1. «Декстралинк» (изделие медицинского назначения) протектор роговицы (рибофлавина мононуклеотид 1мг, декстран 200 мг), регистрационное удостоверение № ФСР 22010/09071 от 14.10.2010 г., ГУ «Уфимский НИИ глазных болезней» Академии наук Республики Башкортостан, Россия;

    2. Анестезирующие лекарственные средства: - «Алкаин» («Alkain») (0,5% Sol. Proxymetacaini) раствор для инстилляций («Аlcon-Couvreur», Бельгия);

    3. Местные антибактериальные средства – «Офтаквикс» («Oftaquix») (0,5% Sol. Levofloxacini) раствор для инстилляций, («SANTEN, OY», Финляндия) или его аналоги, зарегистрированные в установленном порядке;

    4. Местные стимуляторы регенерации тканей – «Корнерегель» («Corneregel») (Dexpanthenol), 5,0% гель глазной (BAUSCH&LONB, «Доктор Герхард Манн, химико-фармацевтическое предприятие ГмбХ», Германия) или его аналоги, зарегистрированные в установленном порядке.

    2.1.2. План проведения экспериментальной части исследования

     Экспериментальная часть исследования включала следующие этапы:

    1. Проведение экспериментальных исследований, подтверждающих безопасность модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена:

    1.1. Проведение фотометрического метода исследования

    1.2. Проведение метода колориметрического анализа

    1.3. Проведение гистологических методов исследования

    2. Проведение экспериментальных исследований in vivo, подтверждающих эффективность модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена

    2.1.2.1. Проведение экспериментальных исследований, подтверждающих безопасность модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена

    Достаточное пропитывание стромы роговицы рибофлавином является необходимым условием для безопасного проведения операции кросслинкинга роговичного коллагена. В ходе экспериментального этапа работы физико – химические и гистологические методы исследования проводились для подтверждения достаточности насыщения роговицы раствором «Декстралинк» при проведении модифицированной методики роговичного коллагена.

    2.1.2.1.1. Фотометрический метод исследования

    В исследовании использовался фотометрический метод определения концентрации растворов, который основан на сравнении поглощения при пропускании света через себя стандартным и исследуемым растворами (в данном случае раствором рибофлавина).

    Этот этап исследования проводился на 30 свиных кадаверных глазах (давность забора – 2 часа).

    Кадаверные глаза были распределены в 3 группы:

    1. 1-я группа (10глаз) – глаза, подвергшиеся стандартной методике КРК

    2. 2-я группа (10 глаз) – глаза, подвергшиеся модифицированной методике КРК

    3. 3-я группа (10 глаз) – интактные глаза (контрольная группа)

    В ходе эксперимента каждый глаз помещали в держатель, для создания необходимого уровня тургора глазного яблока (рис. 1), после чего в 1-й группе эпителий удаляли механически в центральной оптической зоне диаметром 8,0 мм, во 2-й группе проводили точечную эксимерлазерную абляцию с использованием описанного инструмента на глубину эпителиального слоя (50,0 мкм), под контролем интраоперационной on-line пахиметрии (опция эксимерного лазера «Schwind –Amaris 500») (рис. 2).

    Далее в обеих группах на поверхность глазного яблока устанавливалась пластиковая воронка, которую заполняли 1,0 мл раствора «Декстралинк» (рис.3).

    Продолжительность этапа насыщения составила 15 минут во всех случаях.

    С помощью измерительной лабораторной пипетки (5 мл), градуированной до 0,1 мл, производился забор оставшегося раствора «Декстралинк» с точностью до 0.1 мл. Оставшийся раствор помещался в отдельные пробирки.

    Степень поглощения света исследуемых растворов измеряют с помощью фотоколориметров. В данном случае использовался фотоэлектроколориметр КФК – 2МП. В качестве «нулевого» раствора использовалась дистиллированная вода. Оптическая плотность дистиллированной воды составила D = 0,05.

    Все фотоколориметры снабжены светофильтрами – окрашенными средами (стеклами, пленками или растворами), пропускающими лучи только определенной области спектра. Подбор необходимого светофильтра проводился с использованием справочной таблицы [6, 44, 47]. В данном случае был подобран синий светофильтр (λ max = 445 нм). Определение концентрации рибофлавина в исследуемых растворах проводилось с помощью калибровочного графика. Принцип построения калибровочного графика состоит в следующем: готовятся несколько стандартных растворов – 5 – 7 с известным содержанием определяемого вещества. В каждом стандартном растворе измеряется его оптическая плотность с помощью фотоколориметра КФК – 2МП. По результатам измерений строится график, где по оси ординат откладывается оптическая плотность раствора, измеренная фотоколориметром, а по оси абсцисс – соответствующая ей концентрация рибофлавина.

    В данном исследовании в ряд из 7 пробирок помещали по 1,0 мл стандартного образца раствора «Декстралинк», содержащего 1,0 мг лекарственного вещества в 1,0 мл раствора. В первую пробирку добавили 1,0 мл дистиллированной воды, во вторую и последующие пробирки -дистиллированную воду в объеме на 0,5 мл превышающем предыдущий. Растворы перемешивались. После этого из каждой пробирки отбирали пробы объемом 2,0 мл, помещали в кювету с толщиной слоя 10,0 мм измеряли их оптическую плотность с помощью фотоколориметра в синем светофильтре (λ max = 445 нм).

    Далее проводился этап УФ-облучения согласно «Дрезденскому протоколу», после чего роговицы глаз всех трех групп изолировались трепаном для проникающей кератопластики с диаметром просечки 9,0 мм для проведения дальнейших этапов эксперимента.

    2.1.2.1.2. Метод колориметрического анализа

    Колориметрический анализ насыщения роговицы раствором рибофлавина проводился по системе RGB (red, green, blue) с помощью программы Колориметр Digital Color версии 5.10 операционной системы OS X Capitan (10.11.2).

    Для исключения фотоизображений с различным уровнем яркости и освещенности проводили фоторегистрацию одновременно сразу двух исследуемых роговиц, расположенных рядом относительно друг друга, после их насыщения раствором «Декстралинк» при выполнении операции КРК по стандартной и по модифицированной методике, а также исследовалась интактная роговица, не окрашенная раствором рибофлавина (контрольная группа). В каждой группе было по 10 кадаверных свиных глаз.

    Колориметрический анализ каждого глаза проводился трижды в оптической зоне роговицы с определением средних значений показателей RGB. Сравнивались средние значения показателей RGB, полученных при проведении как стандартной, так и модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена.

    2.1.2.1.3. Гистологические методы исследования

    По окончании колориметрического анализа изолированные роговицы погружали в раствор формалина для приготовления препаратов и проведения дальнейшего гистологического исследования.

    Методика гистологической проводки

    После кратковременной фиксации роговицы в 10% растворе забуференного формалина, продолжающейся 1 или 2 дня, производилось обезвоживание роговиц в возрастающей концентрации спиртов, просветление в ксилоле и заливка в парафин. Изготовление срезов проводилось на ротационном микрокератоме Leica 2160 (Германия). Серийные поперечные срезы роговицы помещались на предметные стекла с poly-L-Lysin (Menzel-Glaser).

    Окраска гематоксилин-эозином

    Срезы снимались с лезвия микротома для расправления на теплую водяную баню и монтировались на обычные предметные стекла, после чего они высушивались в течение нескольких часов на нагретой поверхности. Далее проводилось депарафинирование срезов, доведение их до воды, окрашивание гематоксилин-эозином, обезвоживание, просветление и заключение в бальзам.

    Окраска по Ван Гизону

    1) срезы перекрашивают в свежеприготовленном гематоксилине Вейгерта, выдерживая в нем 3–5 минут;

    2) основательно прополаскивают в двух порциях водопроводной воды, ввиду обильного отхождения краски;

    3) окрашивают в пикрофуксине 2–3 минуты;

    4) быстро прополаскивают в воде в течение 5–10–15 секунд;

    5) проводят через 96°спирт, повторно наливая и выдерживая в нем 1–2–3 минуты;

    6) просветляют в карбол-ксилоле, обрабатывают ксилолом и заключают в бальзам.

    Пикрофуксин обладает дифференцирующим действием (за счет пикриновой кислоты) по отношению к железному гематоксилину, почему и допускается перекрашивание последним. Качество окраски контролируется под микроскопом, для чего срез повторно извлекают из пикрофуксина и быстро прополаскивают в воде.

    Срезы окрашивались гематоксилин-эозином для оценки толщины и состояния клеток переднего эпителия роговицы, а также по Ван Гизону для визуализации плотности и ориентации коллагеновых волокон в строме роговицы. Сравнивались результаты гистологического исследования роговиц, подвергнутых как стандартной, так и модифицированной методике кросслинкинга роговичного коллагена.

    2.1.2.2. Проведение экспериментального исследования in vivo, подтверждающего эффективность модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена

    Для подтверждения эффективности модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена проведение операций КРК было смоделировано в эксперименте на глазах экспериментальных животных.

    В качестве материала экспериментальных исследований были использованы глаза 10 кроликов породы шиншилла массой от 2,5 до 3,5 кг бело -серой масти. Глаза кроликов были разделены на 2 группы: 1-я группа – контрольная (10 правых глаз, на которых проводилась операция по стандартной методике КРК). 2 -я группа – исследуемая (10 левых глаз, на которых проводилась операция по модифицированной методике КРК).

    Экспериментальное исследование было проведено с соблюдением международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.

    До операции всем животным проводилась ОКТ роговицы для определения толщины эпителиального слоя роговицы.

    Хирургические вмешательства проводились под местной инстилляционной анестезией 0,5 % Sol. Proxymetacaini стерильным инструментом.

    Стандартная методика проводилась по «Дрезденскому протоколу». В центральной оптической зоне роговицы проводилась полная механическая деэпителизация участка диаметром 8,0 мм, инстиллировался протектор роговицы «Декстралинк» в течение 30 минут (20 инстилляций), после чего выполнялось воздействие УФ-излучения длиной волны 365 нм интенсивностью 3,0 мВт/см² (5,4 кДж/см²) с использованием прибора для кросслинкинга роговичного коллагена «UV -X версия 1000» («IROCAG», Швейцария). Одновременно проводились дополнительные инстилляции раствора «Декстралинк» - 1-2 капли каждые 2 минуты. Воздействие ультрафиолетом осуществлялось в течение 30 минут, после чего в конъюнктивальную полость инстиллировался раствор антибиотика – 0,5%Sol. Levofloxacini.

    При выполнении модифицированной методики на фоне местной инстилляционной анестезии 0,5 % Sol. Proxymetacaini на расчетную глубину, составляющую толщину эпителиального слоя по данным ОКТ роговицы, с использованием диафрагмирующей решетки, изготовленной для проведения эксперимента, накладываемой на роговицу кролика, проводилось воздействие эксимерного лазера «Schwind–Amaris 500» («Schwind GmbH&Co. КG», Германия) по программе ФТК методом «летающего пятна» на эпителий роговицы кролика. После проведения абляции выполнялось контрольное исследование ОКТ роговицы. После этого операция продолжалась: под местной инстилляционной анестезией на роговицу устанавливалась пластиковая воронка и заполнялясь раствором «Декстралинк» в объеме 1 мл. Воронка находилась на поверхности глаза в течение 15 минут, после чего с помощью щелевой лампы с кобальтовым светофильтром оценивалась достаточность насыщения роговицы раствором рибофлавина по полному прокрашиванию роговицы и появлению раствора во влаге передней камеры. Далее проводился этап УФ-облучения, как и при выполнении стандартной методики (рис. 4) После проведения операции в конъюнктивальную полость инстиллировался раствор антибиотика – 0,5% Sol. Levofloxacini.

    Сроки наблюдения составили 1 сутки, 1 месяц. В ходе эксперимента на сроках наблюдения с помощью офтальмобиомикроскопии оценивались такие критерии, как скорость реэпителизации роговицы, особенности течения раннего послеоперационного периода, в том числе наличие и характер осложнений. При проведении ОКТ роговицы оценивалось появление специфических морфологических изменений роговицы в результате проведения как стандартной, так и модифицированной методики кросслинкинга роговичного коллагена.


Страница источника: 51-62

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru