Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Методы экспериментальных исследований


1----------

    2.2.1. Морфологические методы исследования

     Иммуногистохимические исследования типов коллагена проводили с помощью непрямого иммуноферментного метода (ELISA) с помощью системы стрептавидин-биотин, конъюгированной пероксидазой (LSAB, DAKO, США) на 2-х роговичных дисках диаметром 9,0 мм, полученных при кератопластике у пациентов с кератоконусом IV стадии, и 2-х роговичных дисках роговиц донорских глаз, полученных из патологоанатомического бюро. Данное исследование проводили после получения одобрения этического комитета АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения и социального развития Чувашской Республики и подписания информированного согласия пациентами с IV стадией КК, которым планировали проведение операции СКП.

    Начальный этап процедуры ЦТФКРК – формирование интрастромального кольцевидного тоннеля с помощью фемтосекундного лазера IntraLase FS 60 кГц (АМО) на заданной глубине (150 мкм) внутренним диаметром 4,0 и внешним 8,5 мм – проводили на глазу пациента с кератоконусом непосредственно перед выполнением СКП. Глубина формирования интрастромального тоннеля 150 мкм была выбрана с целью полноценного пропитывания роговичной стромы раствором фотосенсибилизатора посредством пассивной диффузии в выше и нижележащие области от тоннеля, а также для исключения повреждения базальной мембраны эпителия и боуменовой мембраны, с изменений в которых, по данным литературы, начинается процесс развития кератоконуса.

    Стандартную процедуру КРК проводили после удаления роговичного диска у пациента с кератоконусом при кератопластике и включала в себя скарификацию роговичного эпителия диаметром 9 мм с помощью шпателя, инстилляцию 0,1% раствора рибофлавина в декстране «Декстралинк» каждые 5 минут в течение 30 минут, затем облучение ультрафиолетовым светом длиной волны 375-376 нм и плотностью мощности 3 мВт/см² в течение 30 минут. Процедуру УФ кросслинкинга выполняли с использованием аппарата для фототерапии роговицы производства ООО «Трансконтакт» (Москва).

    После удаления диска кератоконусной роговицы, с помощью трепана 9,0 мм, его помещали на тканевую подставку искусственной передней камеры «Barron», далее в сформированный тоннель при помощи шприца с тупоконечной канюлей трехкратно вводили раствор «Декстралинк» с интервалом 5 минут в течение 15 минут в количестве 0,5-0,7 мл до полного пропитывания стромы в выше и нижележащих областях от сформированного тоннеля и просачивания раствора фотосенсибилизатора из входа в тоннель. Последующее циркулярное облучение ультрафиолетовым светом проводили с использованием диафрагмы в виде двух полукруглых сегментов для проецирования УФ облучения на область тоннеля при стандартных параметрах в течение 30 минут.

    При проведении циркулярного и полноапертурного УФ облучения для предупреждения высыхания роговичной ткани выкроенные диски кератоконусных роговиц помещали на тканевую подставку искусственной передней камеры «Barron».

     Донорские глаза, полученные из патологоанатомического бюро, для проведения процедуры стандартного КРК и циркулярного тоннельного фемтокросслинкинга помещали в держатель для глаз.

    После проведения процедуры стандартного и фемтокросслинкинга проводили иммуногистохимические исследования срезов роговицы для выявления типов коллагена в лаборатории микроскопии Казанского Института Биохимии и Биофизики КазНЦ РАН. Последующая морфометрия и анализ локализации различных типов коллагена выполяли на базе Республиканского клинического онкологического диспансера г. Чебоксары совместно с к.б.н. Ларионовым Е.В.

    Стекла со срезами роговиц помещали на 20 минут в 1% раствор перекиси водорода, промывали буферным раствором, раскапывали блокирующий реагент и инкубировали 5 минут во влажной камере. Затем на срезы наносили приготовленные в рабочем разведении моноклональные антитела к коллагенам типа I, II, III, IV и VI (Acrisantibodiesinc., США) в рабочем разведении 1: 500. Инкубировали 30 минут во влажной камере, промывали в трех сменах буферного солевого раствора, после чего наносили связывающие анти-антитела (смесь кроличьих и мышиных антител против антител к коллагену) и инкубировали 15 минут.

    Срезы промывали буферным солевым раствором, раскапывали конъюгированный с пероксидазой стрептавидин, инкубировали 15 минут и проводили гистохимическое выявление пероксидазной активности с помощью раствора диаминобензидина DAB (Novocastra, США) в течение 5-15 минут. Заключение препаратов, окрашенных хромогеном DAB, который устойчив в органических растворителях, производили с помощью канадского бальзама.

    В полученных образцах методом точечного счета с помощью окулярной стереометрической сетки определяли объемную долю коллагена типа I, II, III, IV и VI стромы роговицы, а также уплотнений пучков коллагена стромы («сшивок»), свидетельствующих о формировании новых ковалентных связей между фибриллами коллагена. Для этого использовали результаты оценки 10 случайных наложений сетки, имеющей 100 тестовых точек, на несколько серийно-ступенчатых плоскопараллельных срезов. По числу совпадений тест-точек с изучаемыми структурами, отнесенных к 1000, получали объемную долю в процентах каждого изучаемого параметра.

    Методом трансмиссионной электронной микроскопии проводили изучение и сравнение ультраструктуры ткани роговицы кролика после стандартного КРК и фемтокросслинкинга. Исследование выполняли на базе Института Биотехнологии РАН г. Москва.

    В работе использовали самцов кроликов породы шиншилла, которые были выбраны в связи с относительным сходством роговицы кролика и человека по гистоморфологическому строению и возможности проведения процедуры КРК без изменений стандартного протокола. Исследования выполнены на 18 глазах 9 кроликов. Животные были разделены на 3 группы: 1 (опытная) группа - кролики, которым проводили процедуру кросслинкинга с применением фемтолазера, 2 группа (сравнения) – кролики, которым проводили процедуру стандартного кросслинкинга по цюрихскому протоколу, 3 группа (контроля) - кролики которым проводили только фемтолазерное формирование интрастромального кармана без процедуры кросслинкинга (табл. 3). Срок наблюдения составил 1 неделю, 1 и 3 месяца.

    Процедуру проводили кроликам под общей (внутримышечная инъекция 5% раствора кетамина) и местной (инстилляция 0,3% раствора инокаина) анестезией. Животным 1 группы под местной анестезией выполняли процедуру фемтокросслинкинга с помощью фемтосекундного лазера IntraLase FS 60 кГц (рис.4). Для этого на заданной глубине (150 мкм) формировали карман диаметром 9,0 мм, углом вреза 45 градусов, углом петли 45 градусов. Особенностью данного этапа было наложение вакуумного кольца без векорасширителя, что связано с узостью глазной щели кролика. В сформированный таким образом карман с помощью тупоконечной канюли трехкратно вводили раствор «Декстралинк» с интервалом 5 минут в течение 15 минут в количестве 0,5-0,7 мл до проникновения раствора фотосенсибилизатора из входа в тоннель и полного пропитывания стромы в выше и нижележащих областях от сформированного тоннеля. Последующее облучение ультрафиолетовым светом проводили с использованием диафрагмы в виде двух полукруглых сегментов для проецирования УФ облучения на область тоннеля при стандартных параметрах в течение 30 минут.

    Кроликам 2 группы производили механическое удаление эпителия роговицы диаметром 9,0 мм, затем выполняли инстилляцию раствора «Декстралинк» в течение 30 минут. Облучение роговицы ультрафиолетом (3,0 мВт/см² в течение 30 мин.) в обеих группах осуществляли с помощью аппарата EVOLUTION производства ООО «Трансконтакт», Россия (рис.5).

     В 3 группе животным проводили только процедуру формирования роговичного кармана на заданной глубине (150 мкм) и диаметром 9,0 мм с уголом вреза 45 градусов, уголом петли 45 градусов с помощью фемтосекундного лазера – IntraLasе FS 60 кГц (рис.6).

    На сроках 1 неделя, 1 и 3 месяца кроликов выводили из эксперимента воздушной эмболией, глаза энуклеировали, роговицы вырезали с помощью трепана 9,0 мм.

    Для проведения электронной микроскопии диски роговиц фиксировали в растворе глютаральдегида на фосфатном буфере в течение 24 часов и далее фиксировали осмием. После материал подвергали обезвоживанию в спиртах восходящей концентрации, заливали в эпоксидную смолу. Ультратонкие и полутонкие срезы изготовляли на ультратоме LKB (Швеция). Гистоморфологические исследования проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JЕOL 1200 EX (Япония).

    В полученных образцах оценивали наличие и распределение «сшивок» коллагена стромы, свидетельствующих о формировании новых ковалентных связей между фибриллами коллагена, а также состояние ультраструктуры базальной мембраны эпителия, по изменениям которой можно судить о травматичности этапа удаления эпителия.

    2.2.2. Экспериментальное исследование биомеханических характеристик роговицы после КРК

     Для исследования биомеханических свойств роговицы, с целью проверки гипотезы увеличения прочности роговицы после УФ-кросслинкинга, изучали способность к растяжению образцов роговицы экспериментальных животных, подвергшихся процедуре КРК и фемтолазерного формирования интрастромального кармана. Эксперимент проводился в лаборатории полимеризации НИИ химии при ННГУ им.Н.И. Лобачевского.

    Для экспериментальной работы использовали самцов кроликов породы Шиншилла массой 2-3 кг. Исследования выполняли на 20 глазах 10 кроликов. Глаза животных были разделены на 4 группы по 5 глаз в каждой. Группа 1-я – контроль, 2-я - глаза после СКРК, 3-я - после ЦТФКРК, 4-я - после фемтолазерного формирования интрастромального тоннеля без кросслинкинга.

    Группу контроля составляли глаза кроликов с прозрачными, интактными роговицами. Кроликам 2 группы производили механическое удаление эпителия роговицы диаметром 9 мм, затем инстиллировали раствор «Декстралинк» в течение 30 минут (рис.7,б). Облучение роговицы ультрафиолетом (3,0 мВт/см² в течение 30 мин.) осуществляли с помощью аппарата EVOLUTION производства ООО «Трансконтакт», Россия (рис.7,в). На глазах 3 группы процедуру циркулярного тоннельного фемтокросслинкинга начинали с формирования интрастромального тоннеля с помощью фемтосекундного лазера IntraLase FS 60 кГц. Для этого на заданной глубине 150 мкм формировали кольцевидный канал внутренним диаметром 4,0 мм и внешним 9,0 мм, после чего в радиальном направлении проводили входной разрез длиной 2,0 мм. Энергия импульса составила 1,5-1,8 мкДж. В сформированный таким образом тоннель вводили раствор «Декстралинк» с интервалом 5 минут в течение 15 минут в количестве 0,5-0,7 мл до проникновения раствора фотосенсибилизатора из входа в тоннель и полного пропитывания стромы в выше и нижележащих областях от сформированного тоннеля. Затем в проекции сформированного кольцевидного тоннеля проводили облучение ультрафиолетовым светом с использованием диафрагмы в виде двух полукруглых сегментов при стандартных параметрах в течение 30 минут (рис.7,г). Глаза 4 группы подвергали процедуре фемтолазерного формирования кольцевидного интрастромального тоннеля на глубине 150 мкм внутренним диаметром 4,0 мм и внешним 9,0 мм, но, в отличие от глаз 3 группы, без последующего облучения ультрафиолетовым светом (рис.7,г).

    Через 1 месяц кроликов выводили из эксперимента воздушной эмболией, глаза энуклеировали. Выкраиваемые полоски ткани размером 12 на 20 мм захватывали весь диаметр роговицы и часть склеры для закрепления между лапками универсальной испытательной машины ZWICK/ROELL Z005 на расстоянии 10 мм (рис. 8,9).

    Натяжение повышали линейно со скоростью 50 мм/мин до напряжения в 7 MПa. Полученные результаты фиксировали программным управлением испытательной машины численно и графически.

    Уменьшение растяжимости роговичной ткани расценивали как увеличение ее прочности, произошедшее в результате достижения эффекта УФ-кросслинкинга с формированием новых ковалентных связей, «сшивок» между фибриллами коллагена.


Страница источника: 43-52
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru