Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.7

Влияние all-trans ретиноевой кислоты на культуру склеральных фибробластов кролика


1Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации
2Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации
3Российская детская клиническая больница Минздрава России

     Известно, что ретиноевая кислота (РК) является одним из мощных агентов, регулирующих процессы морфогенеза в нервной системе [6, 18]. Под контролем ретиноидов находится экспрессия значительного количества генов в клетках нейрональной и глиальной природы, в частности кодирующих белки-транспортеры, дофамингидроксилазу, декарбоксилазу глутаминовой кислоты, рецепторы, сопряженные с Gp, ионотропные рецепторы, некоторые ионные каналы, белки цитоскелета, внутриклеточные сигнальные молекулы, фактор роста нервов, молекулы, ассоциированные с нейродегенерацией. Ретиноевая кислота принадлежит к категории регуляторных эндогенных молекул, продуцируемых астроглией [7].

    По современным представлениям хороидальная аll trans ретиноевая кислота выступает вероятным посредником процесса рефрактогенеза.

    Ранее было показано, что при систематическом алиментарном пути поступления ретиноевой кислоты в организм в условиях эксперимента на кроликах и морских свинках наблюдалось увеличение длины глазного яблока [11]. При моделировании депривационной близорукости на животных также было обнаружено повышение уровня ретиноевой кислоты в сетчатке и склере [11].

    Анализ литературных данных дает право сделать вывод о том, что в ремоделировании склеры важная роль принадлежит фибробластам, в которых присутствуют рецепторы ретиноевой кислоты. All-trans ретиноевая кислота ингибирует пролиферацию фибробластов при посредничестве двух семейств ядерных рецепторов: RAR изотипы (α, β, γ) и RXR изотипов (α, β, γ). Связывание лиганда ретиноевой кислоты вызывает ряд конформационных изменений, что позволяет рецептору связывать гистоны ацетилтрансферазы и другие комплексы, активирующие экспрессию генамишени [13, 15, 16].

    Имеются также данные о том, что ретиноевая кислота способна изменять морфологию фибробластов склеры. Последние становятся тоньше, более сморщенными. Под влиянием ретиноевой кислоты расширяются межклеточные пространства и снижается общее количество фибробластов [16, 21].

    All-trans ретиноевая кислота, с одной стороны, изменяет пролиферативную активность, дифференцировку фибробластов [2, 8, 9, 19] за счет увеличения экспрессии белка экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани и лиганда для аггрекана – фибулина-1, а с другой – уменьшает экспрессию аггрекана, гликозаминогликанов, содержащих протеогликаны, играющих важную роль в ремоделировании склеры [9].

    Однако ретиноевая кислота способна не только ингибировать [11, 17], но и стимулировать пролиферацию склеральных фибробластов [5]. Противоречивые результаты влияния аll-trans ретиноевой кислоты на пролиферативную активность фибробластов склеры послужили основанием для проведения настоящего исследования.

    Цель.

    Изучить влияние all-trans ретиноевой кислоты на культуру склеральных фибробластов кролика.

    Материал и методы.

    Экспериментальные исследования были проведены на базе Научно-исследовательского института фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований при Российском национальном исследовательском медицинском университете им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    В качестве объекта исследования были использованы 10 кроликов-самцов породы «шиншилла» с исходной массой тела 2,0-2,5 кг в возрасте 1,5-2 мес. Исследования проведены в соответствии с основными положениями международной резолюции ARVO (Ассоциации по офтальмологии и исследованию зрения). Контрольная группа состояла из 5 кроликов.

    Животных выводили из эксперимента под общим наркозом. Осуществляли внутривенную воздушную эмболию. Далее была произведена энуклеация глазных яблок. Склера очищена от подлежащих оболочек и промыта в фосфатном буферном растворе. Из заднего отрезка каждого глаза вырезали образцы склеры площадью 1 мм 2 . Образцы склеры были помещены под покровное стекло в чашку Петри площадью 25 см 2 (NUNC) в среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин-стрептомицинового раствора (ПанЭко, Россия). Склеру инкубировали при 370 С в условиях 100% влажности с уровнем СО2 5%. Среду меняли каждые три дни. Через две недели после достижения монослоя культура фибробластов кролика была пересажена в новые чашки Петри. Для эксперимента использовался шестой пассаж.

    Определение чувствительности фибробластов к ретиноевой кислоте оценивали с помощью микротетразолиевого теста (МТТ-тест) [12].

    В качестве субстрата в МТТ-тесте использовали соль тетразолия 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) (Sigma-Aldrich).

    Культуру фибробластов помещали в 96-ти луночные планшеты (“Linbro”, UK) (2,5х105 клеток на пробу, объем инкубационной среды 100 мкл) и культивировали 24 часа при 37° С в условиях 100% влажности с уровнем СО 25%. При оценке чувстви-тельности фибробластов в МТТ-тесте all-trans ретиноевую кислоту (Sigma Aldrich) использовали в нескольких концентрациях. Через 24 часа к пробам добавляли all-trans ретиноевую кислоту, разведенную в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 ммоль/л, 0,5 ммоль/л, 0,25 ммоль/л и 0,1 ммоль/л и инкубировали еще 24 часа. В контрольные лунки вместо all-trans ретиноевой кислоты вносили по 100 мкл физиологического раствора. Далее плашки с пробами инкубировали в атмосфере воздуха, обогащенного 5% СО2 , при 37° С в течение 24-х часов.

    По окончании инкубации из каждой лунки декантировали по 100 мкл среды и вносили по 20 мкл раствора МТТ (конечная концентрация- 5 мг/мл). Через 4 часа инкубации (5% СО2 , при 37° С) удаляли среду и добавляли 100 мкл ДМСО. Затем клетки с поверхности снимали раствором трипсина 0,25% (ПанЭко, Россия) и осуществляли подсчет в камере Горяева как общего количества клеток, так и клеток с гранулами формазана.

    Жизнеспособность клеток определяли с помощью добавления к клеткам 10 мкл 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток высчитывали в камере Горяева по формуле: % жизнеспособных клеток = (1,00 – (количество синих клеток/ общее количество клеток)) ×100.

    Статистический анализ результатов исследования проводился согласно общепринятым методикам с помощью программных средств Microsoft Office 2007 для операционной системы Windows-XP и программы STATISTICA 10.0. Статистические данные в условиях нормального распределения представлены средней арифметической ± ошибка средней арифметической (M±m). Статистически значимыми считали результаты с уровнем значимости р<0,05 (95% уровень значимости).

    Результаты.

    Микротетразолиевый тест как метод оценки выживаемости клеток in vitro был предложен в 1983 г. T.Mosmann [12]. По мнению автора, МТТ-тест отличается от других методов простотой, доступностью, быстротой исследования, достаточно высокой информативностью. Метод основан на способности соли тетразолия (используемой в качестве субстрата) под влиянием ферментных систем живых клеток превращаться в формазан, окрашенный в синий цвет. Показано, что для разных типов клеток характерна различная активность дегидрогеназных систем [3, 4, 12]; мертвые же клетки теряют способность синтезировать формазан [10, 14], что и позволило предложить МТТ-тест для определения в суспензии доли живых клеток. Количество (в сравнении с контролем) образовавшегося после того или иного воздействия формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках и может являться критерием степени их чувствительности к тому или иному виду воздействия [3, 4].

    Проведенные нами исследования показали: при концентрации all-trans ретиноевой кислоты 0,5 ммоль/л, 0,25 ммоль/л и 0,1 ммоль/л, добавленной к культуре фибробластов, наблюдалось достоверное, в сравнении с контролем, увеличение количества клеток с гранулами формазана. При концентрации alltrans ретиноевой кислоты 1 ммоль/л уже 21,05±2,35% клеток содержали гранулы формазана(рис.). То есть добавление к культуре клеток all-trans ретиноевой кислоты вызывает достоверное увеличение их количества с гранулами формазана, что подтверждает рост числа жизнеспособных клеток [7] и, по нашему мнению, свидетельствует о стимуляции пролиферации фибробластов. Это находит подтверждение и в ранее выполненных исследованиях [5].

    Определенный научный и практический интерес представляет оценка цитотоксичности all-trans ретиноевой кислоты с помощью окраски клеток трипановым синим. При анализе обращает на себя внимание тот факт, что больше всего фибробластов погибло при концентрации all-trans ретиноевой кислоты 0,1 ммоль/л, тогда как при других концентрациях процент погибших клеток не достоверно отличался от контроля (табл.).

    Полученные данные позволили нам сделать предположение, что all-trans ретиноевая кислота способна быть донатором свободных радикалов, которые вступают в процесс одноэлектронного восстановления кислорода с участием клеточного мембран-связанного мультимолекулярного ферментного комплекса (НАДФН-оксидаза). Полагаем, что в этом случае активация процесса перекисного окисления липидов способна объяснить почти 20% гибель фибробластов при концентрации ретиноевой кислоты 0,1 ммоль/л. Приведенные выше сведения служат дополнением к более ранней нашей публикации по изучению характеристик популяций Т- и В- лимфоцитов, NK- клеток и активационных маркеров у детей с приобретенной близорукостью в зависимости от исходного состояния иммунной системы [1].

    Заключение.

    Таким образом, обнаруженные нами в эксперименте закономерности чувствительности фибробластов к ретиноевой кислоте позволяют утверждать, что с увеличением концентрации all-trans ретиноевой кислоты повышается пролиферация фибробластов. Факт стимуляции пролиферации фибробластов является важным обоснованием роли all-trans ретиноевой кислоты в ремоделировании склеры. Однако это лишь первый шаг на пути более углубленных исследований патогенеза близорукости.

    

    Сведения об авторах

    Хамнагдаева Надежда Вениаминовна – аспирант кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Обрубов Сергей Анатольевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Семенова Людмила Юрьевна – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Салмаси Жеан Мустафаевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России

    Порядин Геннадий Васильевич – доктор медицинских наук, чл.-корр. РАН, заведующий кафедрой патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Казимирский Александр Николаевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России

    Кузнецова Юлия Дмитриевна – врач-офтальмолог отделения микрохирургии глаза ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Минздрава России.


Страница источника: 18-24

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Эндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференцияЭндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенациональн...

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Рейтинг@Mail.ru