Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Технология создания 3D-сфероидов клеточных культур мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба с индуцированными нейропротекторными свойствами


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ
2Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
3Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук

    Актуальность

     В настоящее время все больше литературных данных накапливается о том, что первичная открытоугольная глаукома – мультифакториальное нейродегенеративное заболевание [2].

    Известно, что основным патофизиологическим механизмом гибели нейронов при глаукомной оптической нейропатии является апоптоз [8]. Среди растущего числа пусковых факторов апоптоза особо следует выделить блокаду аксоплазматического транспорта нейротрофических факторов (НТФ) [7].

    Среди большого семейства нейротрофических факторов в последнее время наибольшее внимание исследователей привлекают фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).

    В экспериментах in vivo была доказана выраженная нейропротекция ганглиозных клеток сетчатки данными нейротрофическими факторами [4, 5].

    Однако в настоящее время вопрос о безопасной и длительной доставке НТФ все еще остается трудно преодолимым препятствием, непосредственная доставка нейротрофических факторов в область повреждения оказывает очень кратковременный эффект вследствие быстрого их расщепления ферментами организма протеазами.

    Интересным представляется применение стволовых клеток, способных оказывать длительное и локализованное влияние, опосредованное секрецией синергически действующих факторов [3].

    Известно, что мезенхимальные клетки лимба относятся к истинным мультипотентным мезенхимальным стволовым клеткам (ММСК). В работе Liang C.M. с соавт. было показано, что лимбальные ММСК способны выделять нейротрофические факторы и оказывать нейропротекторное действие [6].

    Установлено, что культивирование в 3D-системах способствует сохранению фенотипа клеток и поддержанию их дифференцированного и секреторного потенциала. Эти данные открывают перспективы использования 3D-сфероидов лимбальных ММСК для обеспечения нейропротекторного действия.

    Цель

    Разработать технологию создания 3D-сфероидов из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба кадаверных глаз человека с индуцированными нейропротекторными свойствами.

    Материал и методы

    По предложенной ранее технологии получали первичные культуры ММСК из тканевых фрагментов лимба [1]. Для исследования нами взяты 8 донорских глаз от 4 трупов доноров в возрасте от 29 до 63 лет, предоставленные Глазным банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад С.Н. Федорова» Минздрава России. Время от момента констатации биологической смерти до выделения тканевых фрагментов – от 9 до 18 часов. Изолированные кусочки лимба переносили в 25 мм3 культуральные матрасы, культивирование осуществлялось в среде DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), L-глутамин – 0,58 г/л, HEPES – 10 mМ, пенициллин – 10000 ЕД/мл, стрептомицин – 10000 ЕД/мл, амфотерицина В – 1,25 мг/мл, инсулин – 0,4 мкМ, дексаметазон – 10 нМ и 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) при стандартных условиях (5% СО2, 37° C), смена среды проводилась каждые 3 дня. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществляли пассирование культуры с использованием растворов Версена и 0,25% трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия), действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды, плотность клеток при рассеве составляла не менее 300 000 кл./мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием камеры Горяева. В экспериментальных сериях использовали культуры ММСК четвертого пассажа, достигшие 80-90% конфлуэнтности.

    Индукция нейропротекторных свойств осуществлялась по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации: 1 этап – EGF, hbFGF (ПанЭко, Россия), добавка N2 (Life Technologies, США), 2 этап – через 72 часа дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF (R&D Systems, США), 3-изобутил-1-метилксантин (Santa Cruz Biotechnology, США).

    Сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США) тремя способами: I – создание сфероидов из предварительно индуцированных ММСК; II – индукция ММСК в 1 день инкубирования; III – индукция ММСК на 7 день инкубирования. Концентрация клеток 270000 кл/мл.

    Полученные 2D- и 3D-культуры ММСК анализировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 (Olympus, Япония).

    Результаты

     ММСК, полученные при культивировании фрагментов лимба, имели характерную веретеновидную форму и сохраняли высокий пролиферативный потенциал (рис. 1а).

    После проведения индукции морфология клеток значительно изменялась, клетки приобретали нейроподобный фенотип (рис. 1b, c).

    Индуцированные и интактные ММСК лимба 4-го пассажа переводили в условия 3D-культивирования в агарозных планшетах для получения клеточных сфероидов, позволяющие в каждой лунке планшета получать стандартные сфероиды из одинакового количества клеток.

    В 3D-культуре, полученной по I, II и III способу, уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в рыхлые агрегаты, которые к концу 1 суток формировали сфероиды с гладким поверхностным слоем (рис. 2a, b, c). Однако после индукции во II модели сфероиды теряли компактность и гладкость, приобретали неровную бугристую поверхность (рис. 3a, b).

    Процесс сфероидообразования в I и III модели протекал идентично, и к 7 суткам наблюдалось формирование плотного, гладкого сфероида (рис. 2d, e). Проведение индукции на 7 день в III группе привело к сходным с I группой изменениям (рис. 3c).

    Дальнейшая экспозиция клеток в 3D-культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов.

    Выводы

    1. На 1 и 7 сутки инкубирования индукция 3D-конструкций мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости». Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных конструкций.

    2. 3D-конструкции, созданные из индуцированных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба, представляют собой компактные сфероиды с гладкой ровной поверхностью, сохраняющие свою морфологию на протяжении всего периода инкубирования. Данная технология представляется оптимальным методом создания сфероидов с индуцированными нейротрофическими свойствами.


Страница источника: 248-251

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru