Актуальность

     Активатор плазминогена урокиназного типа (АПУ) широко распространен в тканях заднего сегмента глаза, в том числе в стекловидном теле, внутренних слоях и сосудах нейроэпителия, пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) [1]. Активность АПУ и экспрессия его рецепторов (CD87) коррелирует с интенсивностью протеолиза внеклеточного матрикса (ВКМ), клеточной подвижностью, инвазией и адгезией [2]. В органе зрения рецепторы АПУ представлены главным образом в клетках ПЭС и патологических образованиях (субретинальных неоваскулярных мембранах, мембранах при пролиферативной витреоретинопатии) [3].

    Цель

    Изучить влияние АПУ на миграцию и пролиферацию клеток ПЭС в культуре.

    Материал и методы

    Культура клеток ПЭС была получена из донорских глазных яблок путем ферментирования раствором коллагеназы 1 мг/мл (Биолот, Санкт-Петербург, Россия). Культуру выращивали в среде DMEM:F12 c 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) и засевали в культуральные флаконы 25 см2. Клетки ПЭС пассажировали при достижении 70-80% конфлюентности монослоя. В экспериментах использовали клетки 4-5 пассажей. Чистота клеточной линии была тестирована окрашиванием на цитокератины 8, 18 (Thermo Scientific, Rockford, IL, США). Все эксперименты с АПУ («Гемаза», Техноген, Москва, Россия) проводили в среде с 1% содержанием СКРС. Контрольные образцы культивировались в идентичных условиях без АПУ.

    Оценку изменений морфологии клеток под влиянием 50 ЕД/мл АПУ производили на фазово-контрастном микроскопе при увеличении 200 после 24 часов инкубации.

    Изменение миграционной активности клеток было изучено с помощью модифицированного протокола камеры Бойдена с использованием планшетных вставок с диаметром пор 8 мкм (Thermo Scientific) и теста заживления раны культурального монослоя. Оценку изменения миграции под действием 50 ЕД/мл АПУ в модифицированном тесте с камерой Бойдена проводили на сроках 6 и 24 часа. Мигрировавшие клетки, фиксированные на нижней поверхности мембраны планшетных вставок, окрашивали гематоксилином. Количество мигрировавших клеток в поле зрения оценивали на фазово-контрастном микроскопе при увеличении 200. Рану монослоя шириной 1000 мкм формировали наконечником стерильной пипетки. Скорость закрытия раны определяли при фазово-контрастной микроскопии, оценивая культуру каждые 12 часов, в группах образцов после внесения АПУ до концентраций 5, 10, 25, 50 ЕД/мл и контрольных образцах без АПУ. Результат выражали в среднем расстоянии между краями раны.

    Для оценки резистентности к трипсину (отражает прочность взаимодействий клетка-клетка и клетка-субстрат) монослой культуры обрабатывали раствором трипсина (0,125%)-ЭДТА в течение 2 минут. После чего действие фермента нейтрализовали добавлением 20 мкл СКРС, а состояние монослоя оценивали при фазово-контрастной микроскопии. Отделившиеся клетки аккуратно удаляли, а оставшиеся прикрепленными фиксировали, окрашивали гематоксилином и подсчитывали.

    После инкубации в течение 24 часов в присутствии АПУ в концентрациях 5, 10, 25 и 50 ЕД/мл образцы культуры окрашивали иммунопероксидазным методом с использованием антител к маркеру клеточной пролиферации Ki67.

    Статистическую значимость различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), различия находящиеся в пределах p<0,05 считали статистически значимыми.

    Результаты

     Под действием АПУ в концентрации 50 ЕД/мл в культуре увеличивалось количество клеток с выраженным фибробластоподобным фенотипом (веретеновидные клетки). В контрольных образцах клетки равномерно распределялись по культуральной поверхности, в то время как в неконтрольных образцах увеличивалась склонность клеток к формированию скоплений (рис. 1).

    Через 24 часа культивации культура в присутствии ПЭС показала статистически значимое (p=0,012) увеличение миграционной способности в 1,75 раза (рис. 2) в модифицированном тесте с камерой Бойдена. Статистически значимое увеличение скорости заживления раны монослоя было выявлено во всех неконтрольных образцах (концентрация АПУ от 2,5 до 50 ЕД/мл) (рис. 3).

    Тест резистентности к трипсину продемонстрировал уменьшение количества клеток прикрепленных к субстрату после действия трипсина (5,2±1,7 кл/поле в контроле и 0,46±0,32 кл/поле при действии АПУ в дозе 50 ЕД/мл, p<0,001). Количество Ki67-позитивных клеток статистически значимо (p<0,01) увеличивалось с 44,1±8,3 до 61,0±5,8% при увеличении концентрации АПУ с 2,5 до 25 ЕД/мл соответственно и до 68,5±7,3% при концентрации АПУ 50 ЕД/мл (рис. 4).

    Обсуждение

    В данной работе впервые было исследовано влияние АПУ на миграцию и пролиферацию клеток ПЭС в культуре. Эффекты АПУ в отношении ПЭС сводятся к увеличению эпителиально-мезенхимальной трансдифференцировки (ЭМТ), о чем говорит изменение морфологии клеток. По результатам оценки миграционной способности и заживления раны монослоя, АПУ увеличивает миграционную активность клеток ПЭС, что, наиболее вероятно, является следствием стимуляции ЭМТ. Кроме того, АПУ стимулирует клеточную пролиферацию, что проявляется увеличение количества Ki67-позитивных клеток в культуре под действием АПУ. Изменения миграционной активности и пролиферации под действием АПУ имеют дозозависимый характер. По результатам, как морфологического исследования, так и теста устойчивости к трипсину, под действием максимальной исследованной концентрации АПУ клетки ПЭС приобретают тенденцию к более плотному межклеточному взаимодействию.

    Модуляция фенотипа и пролиферативной активности ПЭС имеет существенное прикладное значение, так как эпителиально-мезенхимальная трансдифференцировка и пролиферация клеток ПЭС определяют вероятность развития и выраженность пролиферативной витреоретинопатии [4]. Поскольку АПУ стимулирует миграцию и пролиферацию клеток ПЭС в культуре, существует высокая вероятность, что ингибирование его сигнального пути позволит снизить выраженность опосредованных им пролиферативных изменений in vivo.

    Заключение

    В данном исследовании было показано, что АПУ-опосредованный сигнальный путь стимулирует эпителиально-мезенхимальную трансдифференцировку клеток ПЭС, что сопровождается усилением их миграции и пролиферации. Модулирование АПУ-опосредованного сигнального пути может представлять собой потенциальный способ лечения пролиферативной витреоретинопатии.