Актуальность

     Известно, что в жировой ткани, заполняющей пространство между костными стенками глазницы и ее содержимым, подобно подкожной и висцеральной жировой ткани туловища, содержатся мультипотентные стромальные клетки (МСК) [1, 4]. За последние годы орбитальные МСК подверглись активному изучению, и уже показаны разнообразные положительные терапевтические эффекты их применения [2, 7, 11], преимущественно не за счет терминальной клеточной дифференцировки, а вследствие способности к паракринной регуляции межклеточных процессов в тканях.

    Одним из направлений изучения секреторной способности орбитальных МСК является их влияние на результат восполнения объема глазницы при коррекции энофтальма путем введения препаратов гиалуроновой кислоты [5] или аутотрансплантации жировой ткани. Установлено, что значительную роль в приживлении жирового трансплантата играет ранняя васкуляризация [6]. Раннее было показано, что МСК, выделенные из жировой ткани туловища, экспрессируют такие ангиогенные и антиапоптотические факторы, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов-2, ангиопоэтин-1, трансформирующий фактор роста-ß [3, 9, 10]. Однако данных о способности МСК жировой ткани глазницы секретировать подобные факторы нами не обнаружено.

    Цель

    Определить наличие секреции факторов ангиогенеза мультипотентными стромальными клетками, выделенными из орбитальной жировой ткани человека.

    Материал и методы

    Образцы орбитальной жировой ткани резецировали в ходе плановых реконструктивно-пластических операций по поводу врожденных и приобретенных патологических состояний глазного яблока и его придаточного аппарата. Выделение МСК из орбитальной жировой ткани человека проводили по ранее описанной методике [1], включающей механическое измельчение образца жировой ткани ножницами, ферментативное расщепление раствором коллагеназы и центрифугирование. После этого верхнюю жировую фракцию и осадок переносили в культуральный флакон. Культивирование на всем протяжении эксперимента проводили в среде DMEM/F12 с добавлением 2 ммоль L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; MPBiomedicals, LLC, США) в СО₂-инкубаторе при температуре 370 С и 5% СО₂ в атмосфере. Смену среды проводили на вторые сутки (при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции, а также фрагменты жировой ткани); далее среду меняли каждые 3-4 дня.

    Для определения секреции орбитальными МСК факторов VEGF A и TGF-ß2 проводили забор образцов культуральной жидкости на 2-е и 5-е сутки (через 72 часа после первой смены среды) перед сменой питательной среды на свежую аналогичного состава. До проведения анализа образцы хранили в эппендорфах при температуре -800 С.

    Количественную оценку содержания факторов ангиогенеза в образцах культуральной среды проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (коммерческие наборы «Human VEGF-A Platinum ELISA» (eBioscience), «набор для иммуноферментного анализа трансформирующего ростового фактора ß2 человека», OOO «Альма-Бион») на ИФА-анализаторе для микропланшетов (Asys Hitech) при длине волны 450 нм.

    Статистический анализ данных проводили с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft, США). Проверку на нормальность распределения значений признака проводили с учетом критерия Колмагорова-Смирнова. В связи с ненормальным распределением значений признака данные представлены в формате (медиана; 1-й квартиль, 3-й квартиль). Для сравнения двух зависимых групп (концентрация фактора в динамике) использовали непараметрический критерий Вилкоксона, результаты считали статистически достоверными при р<0,05.

    Результаты

    В исследование вошло 18 культур орбитальных МСК, выделенных из фрагментов орбитальной жировой ткани 14 пациентов в возрасте 3-84 лет.

    По результатам иммуноферментного анализа VEGF A обнаружен в большинстве образцов культуральной жидкости уже на 2-е сутки. Его концентрация варьировала в широких пределах (количественные значения представлены в табл.), однако статистически достоверных различий в зависимости от возраста пациентов, локализации жировой ткани в глазнице и характера орбитальной патологии не обнаружено. При сравнении в динамике к 5-м суткам концентрация VEGF A нарастала в 4-х образцах, где первоначально данный фактор выявлен не был. В остальных образцах культуральной жидкости наблюдалось статистически достоверное снижение концентрации VEGF A (р=0,025).

    Иной профиль секреции наблюдался для TGF-ß2 в тех же клеточных культурах. На 2-е сутки в трех образцах культуральной жидкости определялись невысокие концентрации TGF-ß2, которые к 5-м суткам дополнительно снижались. Обращает на себя внимание, что двое из этих образцов представляли собой культуральную среду от МСК, выделенных из медиальной фракции орбитальной жировой ткани («белый» жир). В свою очередь, в пяти образцах из 15 первоначально негативных по TGF-ß2 на 5-е сутки зарегистрирована секреция данного фактора.

    Достоверных различий в количестве VEGF A и TGF-ß2 в культуральной среде в зависимости от возраста пациентов, характера орбитальной патологии, локализации жировой ткани в глазнице не обнаружено.

    Обсуждение

    Наблюдаемое снижение концентрации VEGF A к 5-м суткам культивирования орбитальных МСК может быть связано с особенностями используемого протокола выделения клеток. Так как после ферментативного расщепления и центрифугирования в культуральный флакон переносили не только стромально-васкулярную фракцию клеток, но и тканевой дебрис, это могло обусловить поступление дополнительных количеств данного фактора. В свою очередь, после первой смены культуральной среды на 2-е сутки не прикрепившаяся к пластику клеточная и тканевая масса удалялась, оставалась практически чистая культура орбитальных МСК. Именно результаты определения концентрации исследуемых факторов на 5-е сутки (т.е. через 72 часа после смены среды) отражают секреторную способность орбитальных МСК.

    Обращает на себя внимание нарастание концентрации TGF-ß2 к 5-м суткам культивирования орбитальных МСК.

    Известно, что белки семейства TGF-ß экспрессируются в культуре адипоцитов, в жировой ткани и тормозят дифференцировку преадипоцитов [8]. В то же время TGF-β1 способен индуцировать экспрессию фактора роста эндотелия сосудов, являющегося основным ангиогенным фактором, регулирующим рост новых кровеносных и лимфатических сосудов [12]. Таким образом профиль и механизмы регуляции секреции ангиогенных факторов орбитальными МСК требуют дальнейшего уточнения.

    Выводы

    Мультипотентные стромальные клетки, выделенные из орбитальной жировой ткани человека, в условиях in vitro секретируют фактор роста эндотелия сосудов и трансформирующий ростовой фактор-β. Это свидетельствует об их потенциальной способности регулировать ангиогенез в тканях глазницы, что может играть положительную роль при аутотрансплантации жировой ткани в глазницу.

    Необходимо дальнейшее детальное изучение профиля секреции этих и других ангиогенных факторов с целью разработки тактики направленного терапевтического ангиогенеза тканей глазницы.