Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Перспективы использования фактора роста костной ткани в составе коллагенового носителя в целях укрепления роговицы (экспериментальное исследование)


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
2Фирма Имтек
3Российский кардиологический научно-производственный комплекс
4Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
5Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации
6Курчатовский институт

    Актуальность

     По данным ВОЗ, не менее 10 млн. чел. во всем мире потеряли предметное зрение из-за заболеваний, так или иначе связанных с патологией роговицы. Успешное развитие кератопластики не может полностью решить всех проблем на данном этапе. Так, при тяжелых ожоговых бельмах IV-V категории по классификации Филатова В.П. и Бушмича Д.Г. (1947) кератопластика является неэффективной, о чем свидетельствуют данные литературы, где частота помутнений трансплантата после кератопластики варьирует от 53 до 82% [1]. В таких случаях единственным методом восстановления зрения является кератопротезирование [2].

    Этот метод даёт хорошие результаты уже на ранних сроках после операции. Однако бельма, подлежащие кератопротезированию, нередко имеют низкие биомеханические характеристики (истонченные, неравномерные по толщине), что значительно усложняет саму операцию и напрямую сказывается на развитии возможных осложнений, наиболее серьезным из которых является развитие асептического некроза роговицы с последующей протрузией кератопротеза [3]. В целях профилактики и лечения подобных осложнений разработаны методы укрепления бельма с использованием разных пластических тканей [4].

    Среди таких операций наибольшее распространение получили методики с использованием аутологичных тканей человека – это укрепление бельма аутонадкостницей большеберцовой кости, фасцией височной мышцы, слизистой оболочкой полости рта, укрепление бельма аутохрящом ушной раковины, аутотеноновой капсулой, перикардом и т.д. [5-7]. По нашему мнению, аутологичные имплантаты из хрящевой ткани дают наиболее хорошие результаты. Хрящевая ткань выполняет опорную функцию в организме, протеогликаны хрящевой ткани имеют способность ускорять процессы регенерации, а сама ткань, будучи бессосудистым образованием, устойчива к условиям ишемизации и недостатка питательных веществ. Кроме того, каркасные свойства хрящевой ткани наиболее удовлетворяют требованиям хирургов, предъявляемым к материалу для укрепления бельм роговицы. Однако использование аутологичных тканей имеет ряд серьёзных недостатков. Во-первых, аутологичные ткани обладают слабыми адаптационными возможностями к неестественному для них биологическому окружению и, как следствие, все они в той или иной степени подвержены лизису как в раннем, так и позднем послеоперационном периоде. Во-вторых, не стоит забывать, что отбор аутоматериала связан с дополнительными, зачастую болезненными операциями. В-третьих, моделирование имплантата нужной формы и размера из аутоматериала, который ограничен в своем объеме, весьма затруднительно. Как следствие, использование аутологичных тканей не всегда даёт стойкий эффект и вынуждает к повторному проведению укрепляющих кератопластик [8].

    В этой связи разработка альтернативных способов, способных в той или иной мере компенсировать вышеперечисленные недостатки, является весьма актуальной задачей. Мы предлагаем сделать это при помощи факторов роста, в частности фактора роста костной и хрящевой ткани rhBMP-2 в составе коллагенового носителя [9]. В доступной литературе нами не обнаружено работ, посвященных изучению и применению фактора роста костной ткани в офтальмологии. Учитывая вышеизложенное, мы считаем перспективной разработку имплантируемого материала содержащего rhBMP-2 и исследование возможностей его применения для консолидации роговичной ткани перед кератопротезированием.

    Цель

    Оценка влияния фактора роста костной ткани rhBMP-2 в составе коллагенсодержащего носителя на клинико-морфологические и биомеханические характеристики роговицы. Влияние rhBMP-2 и коллагенового носителя на пролиферативную активность кератоцитов.

    Материал и методы

    В работе были использованы следующие материалы: стерильный водный раствор нативного коллагена I типа (10 мг/мл) из сухожилий крыс, содержащий 20 мМ уксусной кислоты, pH 3,5 (Q C11-ND, «Имтек», Россия). Водно-солевой раствор, содержащий 3,4 мг/мл rhBMP-2, 10 мМ NaCl, 20 мМ уксусной кислоты, pH 4,5.

    Экспериментальная работа основана на анализе данных, полученных в результате исследования 24 кроликов-самцов породы шиншилла возрастом 6 мес. со средней массой 2,5-3,0 кг. Все процедуры с животными проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животных содержали при естественном освещении, температуре 22±2° С, в свободном доступе к воде и корму. У животных оперировали только один глаз для сохранения ориентации в окружающем пространстве.

    В соответствии с типом имплантируемого материала кролики были разделены на 2 группы. Первую группу составили 12 кроликов (12 глаз), в роговицу которых был имплантирован коллагеновый носитель без фактора роста. Во вторую группу вошли 12 кроликов (12 глаз), в роговицу которых был имплантирован фактор роста rhBMP-2 на коллагеновом носителе. Контролем служили парные интактные глаза.

    Коллоидный раствор крысиного коллагена смешивали с раствором rhBMP-2 таким образом, чтобы в конечной смеси концентрация rhBMP-2 была 20 мкг/мл. Полученную смесь, титруя при постоянном перемешивании, доводили раствором 1 M NaOH до нейтральных значений pH. Инкубировали смесь при + 4°C в течение 2 часов, затем разливали по 1,0 мл в лунки 24-х луночного планшета. Для формирования геля полученную смесь инкубировали при +37° C в течение 30 минут. Образованные коллагеновые гидрогели, извлеченные из планшета, отмывали в 500 мл фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса при комнатной температуре в течение 24 часов с заменой раствора каждые 8 часов. Далее гели выкладывали на поверхность и сушили их до полного высыхания потоком воздуха при +37° C. Полученные пленки регидратировали в 20 мл фосфатного раствора Рингера-Кребса при +37° C в течение 2 часов. В результате чего получали коллагеновую мембрану диаметром 12 мм полусферической формы и толщиной 0,2 мм. Все манипуляции были проведены в асептических условиях.

    Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом фирмы Leica при увеличении в 15 раз, использовали расслаиватель и шовный материал фирмы Mani. Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином. Производился разрез роговицы протяженностью 5 мм на 2/3 ее глубины концентрично лимбу. В данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба», чтобы максимально приблизить данную методику к реальным условиям кератопротезирования. При помощи пинцета для завязывания и шпателя проводилась имплантация тканеинженерной конструкции в полость сформированного кармана, возникающие в некоторых случаях складки имплантируемого материала расправлялись при помощи легкой компрессии, создаваемой шпателем на поверхности роговицы. На разрез накладывался шов по Пирсу. По окончании операции для профилактики инфекции производили подконъюнктивальную инъекцию гентамицина сульфата 1,0% в объеме 0,5 мл. Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин по 1 капле 2 раза в день. Для исключения риска самопроизвольного травмирования оперированного глаза и занесения инфекции кроликам одевались специальные воротники.

    Результаты экспериментов оценивали морфологически, для этого по 2 кролика из каждой группы выводились из эксперимента на 28, 56 и 84 сутки (по 6 кроликов из каждой группы, всего 12). Забой животных осуществляли внутривенным введением фенобарбитала. Глаза животных энуклеировали, и проводили обработку материала для гистологического исследования. Роговую оболочку вырезали по окружности лимба, а затем фиксировали ее в формалине в течение суток. Полученный диск роговицы разрезали пополам, перпендикулярно по отношению к сосудам. Оба фрагмента обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 8-10 мкм изготавливали на микротоме и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование срезов роговицы проводили под световым микроскопом при 16 и 40-кратном увеличении.

    Для исследования биомеханических характеристик оставшиеся животные (12 кроликов) выводились из эксперимента на тех же сроках. Забой животных осуществляли внутривенным введением фенобарбитала. Глаза животных энуклеировали, роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры, отступая 3 мм от лимба. Для чистоты эксперимента использовали свежевыкроенные ткани животных, полученные непосредственно перед проведением исследования. Полученный диск роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием 12 мм в центре, соответствующем диаметру роговицы, таким образом, чтобы фиксация происходила за ткань склеры, а роговица была интактной. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию тканей во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении тканей с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы Instron модели 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530 (рис. 1). По результатам испытаний определяли максимальную нагрузку (характеризует прочность образцов) и наклон упругой области кривой (характеризует жесткость испытуемого образца) (рис. 2). Парные интактные глаза животных, выведенных из эксперимента, были исследованы по той же методике для оценки биомеханических свойств нативных роговиц.

    Для клинической оценки состояния глаз животных по методике Ченцовой Е.В. определяли степень воспалительной реакции и васкуляризацию роговицы, а интенсивность помутнения роговицы оценивали по методике Войно-Ясенецкого В.В. Наблюдаемые изменения регистрировались путем фотографирования на фотощелевой лампе фирмы Opton (Германия).

    Оценку пролиферативной активности кератоцитов проводили по следующей методике: роговица вырезалась из глаза без захвата лимбальной зоны, десцеметова мембрана с эндотелием отделялась физически с помощью пинцета, эпителий соскабливался с помощью скребка. Оставшаяся строма нарезалась с помощью ножниц на кусочки ~1-1,5 мм², которые помещались на поверхность коллагеновой мембраны в культуральной среде (RPMI-1640, 10% фетальной бычьей сыворотки). Кератоциты, полученные на стадии отрастания от кусочков роговицы, снимали с подложки с помощью стандартной процедуры трипсинизации и переносили в лунки 96-луночного планшета с плотностью 30 тыс. клеток/лунку в стандартной культуральной среде (RPMI-1640, 10% фетальной бычьей сыворотки). Через 1 сутки после прикрепления клеток культуральную среду отбирали и вносили вариант культуральной среды со сниженным содержанием сыворотки (2%). В опытные лунки к культуральной среде добавляли фактор роста BMP-2 в 3-х вариантах конечной концентрации: 1, 10 и 30 мкг/мл. Контрольные лунки содержали только культуральную среду. Клетки культивировали в течение 7 дней, после чего оценивали воздействие фактора роста на пролиферативную активность культуры при помощи оптической микроскопии (рис. 3).

    Результаты

    Клиническая картина

     Первая группа (коллаген без rhBMP-2): на первом этапе исследования клиническая картина регистрировалась ежедневно. В раннем послеоперационном периоде (первые 4 суток) в первой группе во всех 12 случаях отмечено наличие незначительного отека роговицы Отек был слабо выражен и обусловлен, по всей видимости, наличием операционной травмы. К началу второй недели (7-е сутки) отек у всех животных отсутствовал. На 14 сутки после операции у 4-х кроликов наблюдалась слабовыраженная васкуляризация роговицы в области операционного шва, которая самопроизвольно регрессировала к концу первого месяца наблюдения. Дальнейшая клиническая картина была стабильной, признаков воспаления не наблюдалось.

    Вторая группа (коллаген с rhBMP-2): к середине второй недели (10 дней) в 6 случаях отмечалась незначительная инъекция новообразованных сосудов эксцентрично лимбу, которая к концу 2-й недели (14 дней) наблюдалась уже у всех животных. Дальнейшая клиническая картина характеризовалась постепенным нарастанием неоваскуляризации роговицы c помутнением имплантата. К началу первого месяца (28 дней) у всех кроликов клиническая картина стабилизировалась. Клинических признаков острого инфекционного поражения окружающих тканей при осмотре не обнаружено. Через 2 мес. клинически значимых изменений не отмечалось. К концу периода наблюдения (84 дня) у всех кроликов наблюдалось наличие бельма 2-й категории по классификации Филатова-Бушмича, выраженная васкуляризация и утолщение тканей роговицы.

    Световая микроскопия

    Первая группа (коллаген без rhBMP-2): роговица относительно равномерной толщины с минимальными изменениями. Имплант сохранен на всем его протяжении, хотя и с очагами истончения, частичного расщепления и накоплением в таких участках отечной жидкости. Роста грануляционной или соединительной ткани не выявлено. В образце 1 мес. – выражен отек стромы, особенно вокруг импланта. В строме нарушение упорядоченности хода пучков коллагеновых волокон (разнонаправлены и различной толщины), но клеточность не повышена. Выявляются единичные новообразованные хорошо сформированные сосуды микроциркуляторного русла, преимущественно вокруг (выше и ниже) импланта. Передний эпителий толщиной от 2-х до 4-х слоев, без особенностей. Передняя пограничная (боуменова) и задняя (десцеметова) мембраны без особенностей. В образце 2 и 3 мес. – аналогичная морфологическая картина, однако значительно меньше выражен отек стромы и более упорядочен ход ее коллагеновых волокон.

    Вторая группа (коллаген с rhBMP-2): роговица относительно равномерной толщины с минимальными изменениями. Имплант сохранен на всем его протяжении, местами с очагами истончения, частичного расщепления. В образце 1 мес. – умеренно выражен отек стромы, особенно вокруг импланта. В строме нарушение упорядоченности хода пучков коллагеновых волокон (разнонаправлены и различной толщины), но клеточность не повышена. Очаговый рост грануляционной и соединительной ткани с новообразованными хорошо сформированными сосудами микроциркуляторного русла, преимущественно вокруг (выше и ниже) импланта, но также и в толще роговицы. Передний эпителий толщиной от 2-х до 4-х слоев, без особенностей. Передняя пограничная (боуменова) и задняя (десцеметова) мембраны без особенностей. В образце 2 и 3 мес. – аналогичная морфологическая картина, однако значительно меньше выражен отек стромы и отсутствуют очаги роста грануляционной ткани, выявляется большее число сформированных новообразованных сосудов микроциркуляторного русла.

    Исследование биомеханических свойств

    Результаты биомеханических испытаний представлены на рисунках и в таблице.

    Из анализа формы деформационных кривых видно, что у исходной роговицы присутствуют участки как упругой, так и смешанной деформации, в то время как у импланта наблюдается практически только упругий участок, после которого происходит разрушение образца. Также видно, что максимальная нагрузка разрушения у импланта ниже, чем у нативной роговицы. Через месяц после имплантации деформационная кривая имеет вид качественно сходный с нативным образцом, но при этом существенно возрастают как максимальная нагрузка, так и наклон упругой области. При исследовании образцов роговицы с большими послеоперационными сроками наблюдается постепенное исчезновение участка смешанной деформации, и форма кривой качественно похожа на деформационную зависимость импланта.

    Как видно из результатов, представленных в табл. и на рис. 1-2, измеренные механические параметры симбатно растут с увеличением послеоперационного срока. Из приведенных данных также видно, что механические характеристики, скорее всего, не достигли своих максимальных значений и можно ожидать их роста еще в течении 2-х – 4-х мес. Можно также сказать, что оперированная роговица обладает существенно большими, по сравнению с нативной, упругими свойствами, что позволит ей выдерживать большие статические и динамические нагрузки без разрушения.

    После прикрепления к мембране кусочков от них отрастали кератоциты и, размножаясь, заполняли всю поверхность мембраны. Таким образом, данная мембрана поддерживает прикрепление, миграцию и пролиферацию кератоцитов роговицы кролика.

    В присутствии фактора роста BMP-2 в исследованных концентрациях клетки через 7 суток достигают конфлюэнтного монослоя. В контрольных лунках картина не отличается от опытных вариантов.

    Обсуждение

    Таким образом, в ходе данного исследования удалось установить, что нативный коллаген способен хорошо приживаться в роговице и постепенно замещаться собственными тканями, а также способен удерживать фактор роста rhBMP-2. Значительное увеличение прочностных свойств роговицы на всех этапах эксперимента свидетельствует о перспективности данной работы и требует дальнейшего изучения.

    Заключение.

    Доказана принципиальная возможность изменения морфологических и биомеханических свойств тканей роговицы под действием фактора роста rhBMP-2, что является перспективным направлением для укрепления бельм на различных этапах кератопротезирования.


Страница источника: 11-16

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru