Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Технология создания 3D-сфероидов клеточных культур ММСК лимба с индуцированными нейропротекторными свойствами


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
2Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова
3Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук

    Актуальность

     В настоящее время все больше литературных данных накапливается о том, что первичная открытоугольная глаукома – мультифакториальное нейродегенеративное заболевание [2].

    Известно, что основным патофизиологическим механизмом гибели нейронов при глаукомной оптической нейропатии является апоптоз [8]. Среди растущего числа пусковых факторов апоптоза особо следует выделить блокаду аксоплазматического транспорта нейротрофических факторов (НТФ) [7].

    Среди большого семейства нейротрофических факторов в последнее время наибольшее внимание исследователей привлекают фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).

    В экспериментах in vivo была доказана выраженная нейропротекция ганглиозных клеток сетчатки данными нейротрофическими факторами [4, 5].

    Однако в настоящее время вопрос о безопасной и длительной доставке НТФ все еще остается трудно преодолимым препятствием, непосредственная доставка нейротрофических факторов в область повреждения оказывает очень кратковременный эффект вследствие быстрого их расщепления ферментами организма протеазами.

    Интересным представляется применение стволовых клеток, способных оказывать длительное и локализованное влияние, опосредованное секрецией синергически действующих факторов [3].

    Известно, что мезенхимальные клетки лимба относятся к истинным мультипотентным мезенхимальным стволовым клеткам (ММСК). В работе Liang C.M. с соавт. было показано, что лимбальные ММСК способны выделять нейротрофические факторы и оказывать нейропротекторное действие [6].

    Установлено, что культивирование в 3D-системах способствует сохранению фенотипа клеток и поддержанию их дифференцированного и секреторного потенциала. Эти данные открывают перспективы использования 3D-сфероидов лимбальных ММСК для обеспечения нейропротекторного действия.

    Цель

    Разработать технологию создания 3D-сфероидов из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба кадаверных глаз человека с индуцированными нейропротекторными свойствами.

    Материал и методы

    По предложенной ранее технологии получали первичные культуры ММСК из тканевых фрагментов лимба [1]. Для исследования нами взяты 8 донорских глаз от 4 трупов доноров в возрасте от 29 до 63 лет, предоставленные Глазным банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад С.Н. Федорова» Минздрава России. Время от момента констатации биологической смерти до выделения тканевых фрагментов – от 9 до 18 часов. Изолированные кусочки лимба переносили в 25 мм3 культуральные матрасы, культивирование осуществлялось в среде  DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), L-глутамин – 0,58 г/л, HEPES – 10 mМ, пенициллин – 10000 ЕД/мл, стрептомицин – 10000 ЕД/мл, амфотерицина В – 1,25 мг/мл, инсулин – 0,4 мкМ, дексаметазон – 10 нМ и 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) при стандартных условиях (5% СО2, 37° C), смена среды проводилась каждые 3 дня. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществляли пассирование культуры с использованием растворов Версена и 0,25% трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия), действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды, плотность клеток при рассеве составляла не менее 300 000 кл./мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием камеры Горяева. В экспериментальных сериях использовали культуры ММСК четвертого пассажа, достигшие 80-90% конфлуэнтности.

    Индукция нейропротекторных свойств осуществлялась по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации: 1 этап EGF, hbFGF (ПанЭко, Россия), добавка N2 (Life Technologies, США), 2 этап, через 72 часа, дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF (R&D Systems, США), 3-изобутил-1-метилксантин (Santa Cruz Biotechnology, США).

    Сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США) тремя способами: I – создание сфероидов из предварительно индуцированных ММСК; II – индукция ММСК в 1 день инкубирования; III – индукция ММСК на 7 день инкубирования. Концентрация клеток – 270000 кл/мл.

    Полученные 2D- и 3D-культуры ММСК анализировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 (Olympus, Япония).

    Результаты

     ММСК, полученные при культивировании фрагментов лимба, имели характерную веретеновидную форму и сохраняли высокий пролиферативный потенциал (рис. 1).

    После проведения индукции морфология клеток значительно изменялась, клетки приобретали нейроподобный фенотип (рис. 2).

    Индуцированные и интактные ММСК лимба 4-го пассажа переводили в условия 3D-культивирования в агарозных планшетах для получения клеточных сфероидов, позволяющей в каждой лунке планшета получать стандартные сфероиды из одинакового количества клеток.

    В 3D-культуре, полученной по I, II и III способу, уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в рыхлые агрегаты, которые к концу 1 суток формировали сфероиды с гладким поверхностным слоем (рис. 3).

    Однако после индукции во II модели сфероиды теряли компактность и гладкость приобретали неровную бугристую поверхность (рис. 4).

    Процесс сфероидообразования в I и III модели протекал идентично, и к 7 суткам наблюдалось формирование плотного, гладкого сфероида (рис. 3).

    Проведение индукции на 7 день в III группе привело к сходным с I группой изменениям (рис. 4).

    Дальнейшая экспозиция клеток в 3D-культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов.

    Выводы

    1. На 1 и 7 сутки инкубирования индукция 3D-конструкций мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости». Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных конструкций.

    2. 3D-конструкции, созданные из индуцированных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба, представляют собой компактные сфероиды с гладкой ровной поверхностью, сохраняющие свою морфологию на протяжении всего периода инкубирования. Данная технология представляется оптимальным методом создания сфероидов с индуцированными нейротрофическими свойствами.


Страница источника: 265-268
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru