Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Результаты и обсуждение


1----------

    Разработка метода культивирования клеток и насыщения магнитными частицами

    Для культивирования НЕК-293 применялась среда DMEM (ПанЭко, Россия), при добавлении 10% фетальной сыворотки крови (Perbio HyClone, 14 США), L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 4% гентамицина (ПанЭко, Россия). Культура клеток инкубировалась при 37°С в СО2 инкубаторе. Клетки росли на площади 25 см² , во флаконах («Costar», США). По мере нарастания культуры клеток почек эмбриона человека НЕК-293 до концентрации 1,5 × 105 клеток мл -1 , клетки подвергались трансфекции полученными конструкциями: EGFPN1 («Clontech», США). Трансфекция осуществлялась с помощью реагента ExGene 500 (Fermentas, R0511, США), согласно протоколу. Селекция клонов, несущих встроенную конструкцию, проводилась с помощью реагента-антибиотика гиницитина (G418, Invitrogen # 15750045, США), в течение десяти дней. После селекции с использованием антибиотика клоны, устойчивые к G418, были использованы для анализа с помощью микроскопа (Olympus, Япония). Все колонии были GFP-позитивными. Клетки были рассеяны на 3-см чашки Петри («Corning», США) в количестве около 300 тысяч. Через 24 часа к клеткам были добавлены магнитные частицы Dynabeads M-280 («Invitrogen) (в соотношении 1:100), которые были предварительно обработаны 4% раствором поверхностно активного вещества проксанола 268. Комбинация клеток НЕК/GFP с магнитными частицами культивировалась 24 часа при температуре 37°С в СО2 инкубаторе. Через 24 часа трансгенная культура по гену GFP с магнитными частицами была пятикратно промыта раствором Хенкса (ПанЭко, Россия) и обработана раствором трипсина (ПанЭко, Россия). Коллекцию клеток осуществляли в 1,5 мл эппендорф фирмы Corning (США). Клетки были осаждены на центрифуге фирмы Eppendorf (Германия) в течение 3 минут при 1500 оборотов в минуту.

    Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

    По результатам эксперимента in vitro было показано, что проникновение магнитных частиц внутрь стволовых клеток незначительно (до 15% через 72 часа инкубации) снижает пролиферативную активность. Это говорит о том, что жизнеспособность клеток при данной технологии составляет до 95%. По проведенному анализу литературы были выявлены результаты других авторов, использующих магнитные наночастицы. Жизнеспособность клеток по приведенной ими технологии, достигала лишь 30% к первым суткам (Kyrtatos P.G. et al., 2009; Leong W.S. et al., 2010), что доказывает преимущества разработанной нами технологии.

    Таким образом, разработанная технология культивирования клеток НЕК-293 GFP с магнитными частицами является безопасной, эффективной и может использоваться в экспериментальной практике с целью маркировки или фиксации материала.

    Результаты разработки оригинального магнитного имплантата для эписклеральной фиксации

    Из полимерного эластичного магнитного материала были разработаны имплантаты (пластины толщиной 0,35 мм), круглой формы, диаметром 4 мм, которые намагничивались в импульсных полях индукцией 1,0 Тл. Таким образом, были созданы ПЭМИ с индукцией магнитного поля от 1 до 5 мТл с шагом в 1 мТл. Намагничивание и измерение магнитных свойств материала производилось на аппаратуре фирмы ЗАО «Элмат-ПМ» (Калуга).

    В центре ПЭМИ располагается лазерный зонд производства ООО «Полироник» (Москва), представляющий собой полимерное оптоволокно диаметром 0,25 мкм с изогнутым под 60° концом, где располагается рассеивающая микролинза. Микролинза позволяет фокусировать лазерное излучение на расстоянии 1,0 мм.

    Результаты оценки прочностных, токсикологических, цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов на культурах клеток

    Проведенные исследования показали, что предложенный полимерный эластичный магнитный имплантат оригинальной конструкции является прочным и нетоксичным материалом. Доказано, что ПЭМИ не подвергаются механическим повреждениям в результате гидротермообработки, токсикологические их свойства не выявлены, они не влияют на скорость пролиферации и не обладают ростостимулирующими свойствами, так как ММСК не растут на данном материале.

    Результаты исследования локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза

    Эписклеральное расположение имплантатов вызывало у всех экспериментальных животных развитие умеренно выраженной воспалительной реакции. По данным морфологического исследования вокруг эписклерального ПЭМИ постепенно отмечено развитие фиброзной капсулы, с начальными признаками на 7-е сутки и окончательным формированием к сроку 1 месяц. Далее (до 3 месяцев) пролиферативные явления сменялись склерозированием, что вызвало уплотнение капсулы, и к окончанию эксперимента она была представлена зрелой фиброзной тканью. Таким образом, можно сделать заключение, что разработанный полимерный эластичный магнитный имплантат может применяться для экспериментальной офтальмологии.

    Результаты оценки эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата

    При оценке эффективности взаимодействия клеток, меченных магнитными частицами, и внешнего магнитного имплантата, подведенного под чашки Петри было выявлено, что клетки прикрепляются к поверхности магнита напряженностью 5 мТл в течение 1-го часа и распластываются на поверхности. Это говорит о нетоксичности данного материала и пригодности для полноценного функционирования клеток, а также определяет оптимальную напряженность магнитного поля, равную 5 мТл, достаточную для удержания стволовых клеток, меченных магнитными частицами, в предполагаемой области введения в последующем эксперименте in vivo.

    Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами

    По результатам биомикроскопии в сроки наблюдения 1-3 суток в обеих группах отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, которая проходила к 5-м суткам. На всех сроках наблюдения швы конъюнктивы и склеротомических отверстий были адаптированы. Оптические среды были прозрачны, кроме 3 глаз опытной группы и 2 – контрольной, где визуализировалось помутнение в хрусталике, связанное с повреждением во время проведения хирургического вмешательства. Воспалительных явлений ни в одном случае не наблюдалось.

    По результатам офтальмоскопии на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки в зоне введения клеток, дефект сетчатки и сосудистой оболочки. К 3-м суткам отслойка сетчатки не визуализировалась, но дефект сетчатки и сосудистой оболочки сохранялся. В дальнейшие сроки наблюдения было сложно визуализировать место локального введения клеток. В 3 случаях из опытной группы и в 2 из контрольной проведение офтальмоскопии было затруднительно в связи с помутнением хрусталика.

    По данным ультразвукового исследования на всех глазах опытной и контрольной групп на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки высотой 1,0-1,4 мм, которая к 3-м суткам уменьшилась до 0,4-0,7 мм, а к 5-м суткам полностью регрессировала. Во все сроки наблюдения в обеих группах визуализировалась мелкодисперсная взвесь в стекловидном теле, а в опытной группе – эхо-тень от магнита.

    Данные КТ во всех случаях подтверждали расположение ПЭМИ в правом ретробульбарном пространстве в нижне-латеральном квадранте. Левые орбиты были интактны, патологических очагов выявлено не было.

    По проведенным клиническим исследованиям можно сделать заключение, что предложенная хирургическая методика локального субретинального введения клеточного материала, обладающего потенциальным терапевтическим эффектом, является контролируемой и малоинвазивной, риск травматизации тканей минимален в связи с возможностью визуализации места расположения ПЭМИ за счет диафаноскопии и разработанного устройства дозирования, осуществляющего деликатный доступ в субретинальное пространство.

    По данным морфологического исследования (флюоресцентной микроскопии криосрезов энуклеированных глазных яблок) в первые сутки на всех 6 глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой, в стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были. На всех глазах контрольной группы были обнаружены единичные клетки или группы клеток НЕК-293 GFP в полости стекловидного тела, не связанные с другими структурами глаза.

    На 3-и сутки на всех глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались также в месте введения под сетчаткой. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что группа клеток, находящихся под сетчаткой, являются живыми. В контрольной группе в 3 случаях из 6 в полости стекловидного тела были обнаружены скопления клеток НЕК-293 GFP, не связанные с другими структурами глаза, в остальных 3 случаях клетки HEK-293 GFP обнаружены не были.

    В сроки наблюдения 5, 7, 10, 14, 21 сутки в опытной группе клетки HEK-293 GFP также располагались в месте их введения, но количество клеток снижалось на каждом последующем сроке наблюдения. К сроку 1 месяц клетки обнаружить не удалось ни в одном случае, но на всех 6 глазах наблюдалась присклеральная флюоресценция в зоне подшивания ПЭМИ. В контрольной группе в сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток и 1 месяц клетки не визуализировались.

    В ходе проведенного морфологического исследования было выявлено, что предложенный способ субретинального введения клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, и эписклеральной фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата, является эффективным способом фиксации клеточного материала в месте его локальной имплантации сроком до 21 суток.

    В результате проведения анализа литературных данных, была найдена лишь одна работа по использованию стволовых клеток, меченных суперпарамагнитными частицами для направленной доставки клеточного материала в область сетчатки. Для этого авторы со-культивировали мезенхимальные стволовые клетки с суперпарамагнитными наночастицами и метили клетки маркером Q-Tracker 655. В результате проведенных криогистологических срезов авторы получили достоверные данные о нахождении клеток во внутренних слоях сетчатки в области фиксации магнита только на сроке 1 неделя.

    Таким образом, можно сделать заключение, что впервые разработан комбинированный хирургический способ локального субретинального введения клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, который является эффективным способом фиксации клеточного материала в зоне трансплантации на длительный срок, открывает возможности для пролонгирования действия клеток, обладающих терапевтическим потенциалом, в зоне локального повреждения и позволяет избежать в будущем осложнений, вызванных клеточной трансплантацией, таких как homing-эффект и туморогенный эффект.


Страница источника: 13
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru