Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Материалы и методы исследования


1----------

    В работе использовалась линия стволовых клеток НЕК-293 GFP (human embryonic kidneys), полученная из клеток почки эмбриона человека и выращенная в культуре ткани («Биолот», Санкт-Петербург, Россия) и транфецированная GFP-плазмидой («Clontech», США).

    Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293 магнитными частицами и оценка их взаимодействия с магнитным имплантатом в эксперименте in vitro

    В данной работе были использованы магнитные микрочастицы Dynabeads M-280 («Invitrogen», США) для введения в цитоплазму клеток линии НЕК-293, трансфецированных GFP-плазмидой. Данная методика насыщения использовалась впервые и подробно описана в главе «Результаты исследования».

    Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

    Пролиферативная активность оценивалась методом МТТ теста. Реагент МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид) восстанавли- вается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенного формазана.

    Формазан может быть эллюирован из клеток с помощью органических сольвентов (изопропанол, диметилсульфоксида (ДМСО) и т.д.). Определено, что оптическая плотность эллюатов при длине волны 570 нм (максимум погло-щения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.

    После внесения в культуру клеток магнитных частиц оценивали их жизнеспособность на 1-е, 2-е и 3-и сутки. В качестве контроля использовалась культура клеток без магнитных частиц. Для этого в лунки вносили МТТ и инкубировали в присутствии МТТ (0,25 мг/мл, Serva, Германия) в течение еще 3 часов. Формазан эллюировали с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 30 минут при 37°С и проводили измерение оптической плотности эллюата на планшетном спектрофотометре Multiscan (Nhermo Scientific, США) при длине волны 570 нм.

    Оценка прочностных, токсикологических, цитотоксических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов

    В работе в качестве магнитных имплантатов, которые размещали эписклерально и фиксировали узловыми швами, использовали полимерные эластичные магнитные имплантаты (ПЭМИ) оригинальной конструкции с лазерным зондом, подробно описанные в главе «Результаты исследования».

    Для оценки механических и прочностных свойств магнитного имплантата производили его гидротермообработку по методике ускоренного старения, принятой для испытания полимерных магнитов. Имплантаты выдерживали при температуре 90°С в течение 2 недель, что соответствует 5 годам эксплуатации при нормальных условиях. Затем проводили контроль внешнего вида под микроскопом на наличие механических повреждений.

    Для оценки токсикологических свойств проводили исследование, разработанное в ФГБУ «МНТК «Микрохиругия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России» для офтальмологических изделий в соответствии с требованиями Международного стандарта ISO 10993-1. Выполняли РН-метрию, ультрафиолетовую спектроскопию, иммунотоксический тест, оценивали выживаемость клеток на тест-объекте, наличие аутоиммунных молекулярных комплексов и мутагенности по микроядерному тесту. Измерения проводили относительно контроля (воды). Результаты сравнивали с пороговыми значениями.

    Исследование цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов было проведено путем со-культивирования с культурой мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека (ММСК), оценивали рост культуры ММСК на магнитных имплантатах.

    Исследование локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза

    Было проведено исследование на 24 глазах 12 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. После выполнения анестезии, кроликам в области проекции верхней прямой мышцы, отступя 3 мм от лимба, проводили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 3-4 мм и выделяли верхнюю прямую мышцу. Далее, отступив от лимба 7 мм к склере, в верхнем сегменте нитью 5-0 Dacron (Alcon, США) подшивали полимерный эластичный магнитный имплантат толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм с лазерным зондом, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл, после чего лазерный зонд отрезали конъюнктивальными ножницами на уровне магнитного материала. ПЭМИ подшивали таким образом, чтобы ½ часть имплантата находилась под мышцей (12 глаз). В контрольной группе (12 глаз) аналогично имплантировали силиконовый материал (марки СЛ-150) без магнитного наполнителя. На конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon, США). Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде проводили стандартное клиническое офтальмологическое обследование для животных на 1-е сутки, 1-ю неделю, 1 и 3 месяца. Глаза энуклеировали с последующим морфологическим исследованием проводилась в эти же сроки.

    Оценка эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата

    В эксперименте in vitro под чашки Петри с клетками, меченными магнитными частицами, подводили магнитные имплантаты с разной напряженностью от 1 до 5 мТл и производили маятникообразные колебательные движения, оценивая интенсивность намагничивания. Таким образом определяли оптимальную напряженность магнитного поля, необходимую для удержания клеток в эксперименте in vivo.

    Исследование эффективности метода субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами, в эксперименте in vivo

    Третьим этапом выполняли исследование in vivo на 96 глазах 48 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 месяцев весом от 2,5 до 3,5 кг. Все правые глаза были опытными (48 глаз), а левые (48 глаз) – контрольными. Всем кроликам в оба глаза за 30 минут до операции в конъюнктивальную полость инстиллировали 1-2 капли 1% раствора атропина и 1% тропикамида для достижения медикаментозного мидриаза. В качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли трехкратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Перед операцией всем экспериментальным животным промывали конъюнктивальную полость раствором фурациллина 1:5000. Иммобилизацию животных производили путем тугого бинтования. В опытной группе (48 глаз) после установки блефаростата, отступя 3 мм от лимба, с помощью конъюнктивальных ножниц в нижнем сегменте производили разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 10 мм. Далее выделяли нижнюю прямую мышцу, брали ее на шов-держалку. Затем в 7 мм от лимба в нижнем сегменте на 7 часах подшивали комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом.

    В 3 мм от лимба в верхнем и верхне-наружном сегменте устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела на 1, 2 и 11 часах, фиксировали инфузионную систему, световод, витреотом, выполняли срединную витрэктомию. Суспензию объемом 0,02 мл, содержащую стволовые клетки (n ~ 6000), меченные магнитными частицами, вводили субретинально в область лазерного пятна, полученного в результате диафаноскопии. Клетки вводили субретинально при помощи разработанного нами устройства для дозирования с иглой 25G, на конце которой расположена изогнутая канюля 41G с заточенным нижнем краем. Для предотвращения выхождения клеток через ретинотомическое отверстие сразу после их введения в витреальную полость вводили газо-воздушную смесь в количестве 1,0-1,2 мл. По завершению эксперимента лазерный зонд обрезали на уровне полимерного эластичного магнитного имплантата. На склеротомические отверстия и конъюнктиву накладывали шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon, США). В группе контроля (48 глаз) хирургическое введение стволовых клеток проводили субретинально, но без фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата с лазерным зондом.

    Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде через 3 часа, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 сутки и 1 месяц проводили биомикроскопию, офтальмоскопию глазного дна с фотографированием, ультразвуковое офтальмосканирование, компьютерную томографию (КТ), морфологическое исследование (крио-гистологические срезы).


Страница источника: 9

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru