Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

3.2.Результаты разработки техники подготовки ретинального пигментного эпителия к субретинальной трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования


1----------



    В рамках данной работы подготовка РПЭ к трансплантации предполагает использование 2D культур 5-6 пассажа для формирования трансплантатов РПЭ в форме сфероидов. Второй этап работы связан с выяснением деталей процесса перехода клеток РПЭ из 2D в 3D форму, а именно решались следующие вопросы:

    • Каковы микроскопические и иммуногистохимические характеристики клеток в 2D культурах РПЭ перед их подготовкой к трансплантации?

    • Как технически следует проводить 3D культивирование с тем, чтобы воспроизводимо получать сфероиды РПЭ?

    • Каковы микроскопические и морфометрические особенности формирования сфероидов с применением разработанной техники?

    • Как изменяются фенотипические характеристики клеток РПЭ при последовательном 2D и 3D культивировании?

     Ответы на перечисленные вопросы представлены в разделе 3.2.

    3.2.1. Характеристика двухмерных культур пигментного эпителия

    Суспензию клеток РПЭ, выделенную на первом этапе работы центрифугировали (рис. 3), разбазбавляли питательной средой (рис. 4) и культивировали в стандартных условиях (см. разд. 2.2.1).

    2D культуры РПЭ пассажей P1 и P6 представляли собой клеточные монослои с конфлюэнтностью 80-90%. Заметным микроскопическим отличием было пониженное содержание внутриклеточного пигмента в культуре более позднего пассажа. Форма клеток в пассаже P1 более приближалась к полигональной (рис. 5), в P6 – к вытянутой (рис. 6).

     Для молекулярной идентификации клетки 2D культур пассажей P1и P6 подвергались иммуногистохимическому исследованию для выявления ряда специфических белковых маркеров (см. разд. 2.2.1).

    Иммунногистохимическая характеристика первичной культуры P1

    Иммуногистохимическое исследование показало, что культура на этапе P1 представлена небольшими группами клеток эпителиоидной (близкой к гексагональной) формы, включающих большое количество гранул пигмента меланина.

    Клетки экспрессируют RPE-65, E-кадгерин и ZO-1 (рис. 8.А-С). Также наблюдается относительно слабая экспрессия виментина (рис. 7.D).

    Иммуногистохимическая характеристика пассированной культуры

     P6 В культуре РПЭ пассажа P6 наблюдается изменение морфологии, клетки теряют полярность. Преобладание взаимодействий типа «клетка-субстрат» обусловливает изменения профиля экспрессии маркеров (рис. 8).

    Экспрессия маркеров RPE65 и E-кадгерина практически не выявляется, ZO-1 снижена. В то же время экспрессия виментина нарастает. Перечисленные наблюдения указывают на прогрессию эпителиально-мезенхимальной трансформации в ряду пассажей клеточной культуры.

    3.2.2. Разработка техники подготовки ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования

    В настоящей работе использовали метод получения сфероидов РПЭ методом висячих капель [71] как наиболее простой и воспроизводимый.

    Клеточные 2D культуры 5-6 пассажа с конфлюэнтным монослоем спустя 6-8 недель после выделения донорского материала переводили в 3D культуру. Для этого в чашке Петри с 2D культурой клеток питательную среду заменяли смесью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и раствора Версена (1:1 по объему), и чашку инкубировали в стандартных условиях. Спустя 5 минут инкубации жидкость из чашки Петри переносили в центрифужную пробирку с добавлением 1 мл FBS (для нейтрализации остатков трипсина) и центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли. К образовавшемуся осадку добавляли 105 мкл питательной среды, пипетировали и переносили в отдельную пробирку 105 мкл концентрированной суспензии, 5 мкл которой использовали для подсчета количества клеток при помощи камеры Горяева. От оставшихся 100 мкл концентрированной суспензии забирали x мкл концентрата в отдельную пробирку исходя из расчета:

    



где x – объем концентрата (мкл), n – планируемое посевное количество клеток в одной висячей капле, m – планируемое количество висячих капель, N – фактическое количество клеток в 100 мкл концентрированной суспензии. К х мкл концентрата добавляли y мкл питательной среды, исходя из расчета:

    где y – объем добавляемой питательной среды (мкл), v – планируемый объем одной висячей капли (мкл), m - планируемое количество висячих капель, х – объем разбавляемого концентрата, вычисленный по формуле (1). При y<0 суспензия исключалась из эксперимента.

    Образцы полученной разбавленной суспензии объемом v=20 мкл в форме капли переносили на внутреннюю поверхность сухой крышки чашки RODAC (Replicate Organism Detection And Counting) диаметром65 мм (рис. 9). Далее, крышку с нанесенными на нее образцами суспензии (до 16 образцов на одной крышке) помещали каплями вниз на соответствующую чашку, на дно которой предварительно наливали 2 мл дистиллированной воды для поддержания уровня влажности. Полученные культуры клеток инкубировали в стандартных условиях. Из каждой клеточной 2D культуры (5-6 пассаж) получали по 16 висячих капель различных посевных количеств от каждого донора - по 80 висячих капель от каждого из 11 доноров, по 176 висячих капель каждого из пяти посевных количеств клеток (по 500, 1000, 5000, 25000 и 125000 клеток). При выборе посевных количеств клеток на висячую каплю мы опирались на данные исследований по формированию многоклеточных сфероидов при трехмерном культивировании от нескольких сотен и тысяч [235, 15] до нескольких сотен тысяч клеток [88].

    Таким образом, всего было сформировано 880 висячих капель (3D микрокультур РПЭ) объемом по 20 мкл каждая. Общее количество используемых клеток из каждой 2D культуры составило 2,5х106 . Оставшиеся клетки подвергали криоконсервации для сохранения их пролиферативного потенциала (см. разд. 2.6.2).

    Для культивирования использовали питательную среду того же состава, каким обладала среда на этапе 2D культивирования (см. раздел 2.6.1), что рекомендовано при проведении базовых исследований на 3D культурах [222].

    Замену питательной среды проводили каждые 3-4 дня путем перенесения сфероида в висячую каплю со свежей питательной средой при помощи пипеточных дозаторов.

     3.2.3. Формирование сфероидов ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования

    В первые 24 часа 3D культивирования в пространстве каждой висячей

    капли под действием сил гравитации происходило медленное оседание клеток РПЭ к вершине капли (рис. 10.А.). Параллельно с этим в результате активного клеточного движения и клеточной когезии формировалась неопределенная клеточная масса РПЭ, состоящая из множества мелких агрегатов. К концу 48 часов 3D культивирования формировались первые сфероиды по одному крупному или по несколько среднего размера в одной висячей капле (рис. 10.В), которые в дальнейшем сливались в один большой (рис. 10.С).

    К четвертому дню 3D культивирования во всех висячих каплях наблюдали формирование («сборку») одного большого сфероида, поверхность которого была гладкой и обладала характерным блеском. К концу первой и в течение последующих недель наблюдения у части изначально «гладких» сфероидов на поверхности было замечено появление «бахромы» (рис. 11), при этом ни один бахромчатый сфероид не был замечен в обратной трансформации, т.е. не стал «гладким».

    В висячих каплях с меньшими посевными концентрациями клеток наблюдали сфероиды лишь «гладкой» морфологии вплоть до окончания сроков наблюдения. С увеличением посевных количеств клеток на висячую каплю и сроков 3D культивирования вероятность образования «бахромчатых» сфероидов увеличивалась. В таб. 17 представлена динамика изменения процентного количества сфероидов с «бахромчатой» поверхностью.

     Получаемые многоклеточные микроагрегаты РПЭ имели приближенную к сфере, но все же неправильную форму. Объекты неправильной трехмерной формы не могут быть всесторонне описаны одним измерением. Однако известно, что при описании размеров многочисленных однотипных трехмерных объектов неправильной формы (клеточных ядер, частиц пыльцы, технической пыли и др.) можно считать достаточным результат одного измерения каждого объекта по его произвольной проекции, т.е. определения так называемого диаметра Ферета [193, 31, 117]. В данном случае за диаметр гладкого сфероида принимали максимальный диаметр Ферета, т.е. максимально возможное расстояние между двумя точками видимой на фотографии проекции сфероида (рис. 12). Диаметр бахромчатых сфероидов измерялся по максимальному диаметру Ферета «ядра» сфероида (без учета «бахромы»). Поскольку сфероиды могли спонтанно вращаться в пространстве висячей капли, наибольший диаметр проекции отдельно взятого сфероида мог увеличиваться с течением времени независимо от уровня компактизации вещества.

    Диаметр сфероидов статистически значимо менялся во времени независимо от отдельно рассматриваемого посевного количества клеток в висячих каплях (F-критерий во всех случаях превышал критические значения; таб. 18).

    При попарном применении t-критерия оказалось, что сфероиды статистически значимо уменьшались в диаметре к концу первой недели (во всех случаях p<0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества на 4 и 7 сутки 3D культивирования), и в дальнейшем не претерпевали статистически значимых изменений (p>0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества на 7 и 14, 14 и 21, 21 и 28 сутки). Уменьшение сфероидов на первой неделе культивирования сопровождалось образованием вокруг них пояса клеточного дебриса (рис. 13).

    На результат измерения диаметра отдельно взятого сфероида влиял не только процесс компактизации клеточного вещества, но также и спонтанное вращение сфероида в пространстве висячей капли, так что наибольший диаметр проекции сфероида мог увеличиваться с течением времени.

     Анализ диаметра сфероидов позволяет оценить возможность их имплантации в субретинальное пространство при помощи современных возможностей витреоретинальной хирургии. Так, при сравнении диаметра «гладких» сфероидов на 7 сутки 3D культивирования с внутренним диаметром витреоретинальных игл оказывается, что наиболее подходящими для имплантации с помощью технологий 25-27 Gauge могут являться сфероиды, сформированные в висячих каплях с посевными концентрациями менее 5000 клеток на висячую каплю (таб. 19).

    «Бахромчатые» сфероиды не показали статистически значимого изменения своего диаметра при применении F-критерия (при всех посевных концентрациях нулевую гипотезу отвергнуть не удалось; p>0,05, таб. 20).

    Ни в одном случае – ни при наблюдении за «гладкими», ни за «бахромчатыми» сфероидами – не было замечено тенденции к увеличению диаметра сфероидов. За исключением выделения клеточного дебриса на первой неделе 3D культивирования, ни один сфероид в сроках наблюдения свыше 1 недели вплоть до 28 дня не распался на отдельные клетки.

    3.2.4. Иммуногистохимическое исследование получаемых сфероидов РПЭ

    При иммуногистохимическом анализе сфероидов к концу 2 суток 3D культивирования выявлялась высокая экспрессия виментина в наружных слоях сфероидов и низкая – E-кадгерина и RPE65; ZO-1 экспрессируется диффузно по всему объему сфероида (рис. 14).

    Иммуногистохимическое исследование сфероидов различной морфологии на седьмые сутки 3D культивирования показало, что клетки в составе гладких сфероидов (рис. 15.А) более интенсивно экспрессируют E-кадгерин и менее интенсивно – виментин, по сравнению с клетками бахромчатых сфероидов (рис. 15.B).

    Уровень экспрессии RPE65 выше в «гладких» сфероидах, культивированных в течение 7 суток (рис. 16.А,С), чем в «бахромчатых» сфероидах того же срока культивирования (рис. 16.B,D) и в «гладких» сфероидах 2 суток культивирования (рис. 14.С,D). ZO-1 экспрессируется диффузно по всей толще сфероида.

     Таким образом, на втором этапе работы были получены следующие результаты.

    Дано описание характеристик клеток РПЭ в 2D культуре перед их подготовкой к трансплантации. В процессе 2D субкультивирования наблюдалось изменение микроскопических характеристик слоя клеток – клетки РПЭ теряли внутриклеточную пигментацию, а форма клеток приближалась к вытянутой.

    Описана воспроизводимая техника 3D культивирования, позволяющая получать сфероиды РПЭ с контролируемыми параметрами.

     Определены морфологические и морфометрические характеристики формирующихся сфероидов РПЭ. Выявлены два морфологических типа сфероидов – с «гладкой» и «бахромчатой» поверхностью. Первые обладали характерной динамикой развития – уменьшались в размерах к концу первой недели 3D культивирования (период компактизации), и их поверхность могла становиться «бахромчатой». Сфероиды не изменялись в размере после периода компактизации, что может свидетельствовать об отсутствии пролиферативного процесса внутри сфероидов и указывает на их онкологическую безопасность (сфероиды из атипических клеток имеют склонность к росту in vitro [102]. «Бахромчатые» сфероиды не изменялись в размерах и не проявляли склонности к дальнейшему изменению характера поверхности. Изменяя исходные посевные количества клеток и сроки культивирования удалось получить сфероиды размерами 200-1400 мкм.

    Представлена динамика экспрессии иммуногистохимических маркеров клетками РПЭ в процессе их 2D и 3D культивирования. Профиль экспрессии внутриклеточных маркеров подтвердил, что культивируемые клетки пассажа P1 являлись клетками РПЭ. Далее к пассажу P6 экспрессия эпителиальных маркеров снижалась, а мезенхимальных – возрастала. При 3D культивировании наблюдали возобновление экспрессии эпителиальных маркеров в наружных слоях сфероидов, что может свидетельствовать об обращении процесса эпителио-мезенхимальной трансформации клеток РПЭ при 3D культивировании.


Страница источника: 71

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru