Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

2.6.Лабораторные материалы и методы исследования


1----------

     2.6.1. Нормотермическое культивирование

    Под стандартными условиями инкубации понимали постоянно поддерживаемые температурный режим 37°С и концентрацию CO2 5%, что позволяло поддерживать оптимальное значение pH=7,4 в культурах при использовании питательной среды DMEM/F12 [21].

    Для клеточного и органного культивирования использовали полную питательную среду DMEM/F12 (89 об. %) с добавлением сухого L-глутамина, FBS (10 об. %) и смеси антибиотиков (1 об. %). Питательная среда указанного состава широко используется при нормотермическом культивировании как клеточных культур РПЭ, так и органных культур собственно сосудистой оболочки и ХПК [120, 270, 258, 96, 294]. Смену среды проводили каждые 3-4 дня или ранее при обнаружении отклонений pH от 7,4. Среда содержала индикатор феноловый красный, цвет которого позволяет судить о сдвигах кислотности. В таб. 6 приведена цветовая схема индикатора.

    2.6.2. Криоконсервация/дефростация

     Поскольку второй и третий, а также третий и четвертый-пятый этапы работы были значительно разнесены по времени (результаты второго этапа определяли методику проведения третьего, а по результатам третьего этапа проводили четвертый и пятый), а все использованные в работе культуры клеток являлись неиммортализованными (имели ограниченный пролиферативный потенциал), для предотвращения их преждевременного пролиферативного старения каждая культура подвергалась процедуре криоконсервации на втором и третьем этапах сразу после отбора клеток для 3D культивирования. По получении результатов третьего этапа работы культуры дефростировали и использовали для получения висячих капель на четвертом и пятом этапах работы, которые выполнялись параллельно. Таким образом, на всех этапах удалось использовать близкие генерации клеток одних и тех же культур, так что каждая клеточная культура перевивалась не более 10 раз. Методика криоконсервации в температурном режиме -80 ° С позволяет сохранять жизнеспособность клеткок РПЭ сроком до 6 недель [90]. Без использования метода криоконсервации при непрерывном нормотермическом ведении клеточных культур в течение нескольких месяцев неиммортализованные клеточные культуры достигают пролиферативного предела Хейфлика (~50 клеточных генераций), после чего наступает апоптоз вследствие постепенного необратимого укорочения теломер хромосом делящихся клеток [16].

    Криоконсервация прооводилась по стандартной методике. Клетки извлекали из чашки Петри после их инкубации со смесью 0,25% раствора трипсина и раствора Версена (1:1) в стандартных условиях в течение 10 минут, центрифунировали в режиме 1800 об./мин. в течение 5 минут, сливали супернатант, а осадок ресуспендировали в 1 мл смеси диметилсульфоксида и FBS (10/90 % по объему, соответственно). Полученную суспензию переносили в криопробирку 1,5 мл и замораживали при температурном режиме -80° С.

    Для дефростации замороженную пробирку размораживали при 37°С в течение 5 минут, содержимое разбавляли 5 мл DMEM/F12, центрифугировали в режиме 1800 об./мин. в течение 5 минут, супернатант сливали, а осадок разбавляли 2 мл питательной среды и переносили в чашку Петри (35 мм).

    2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток

    Для оценки жизнеспособности клеточного материала на всех этапах работы использовали тест с трипановым синим. Образец суспензии клеток объемом 5 мкл смешивали с 5 мкл 0,4% трипанового синего, выдерживали в течение 1-2 минут, после чего производили подсчет жизнеспособных (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных) клеток при помощи камеры Горяева [21, 116].

     2.6.4. Перечень использованного лаборораторного оборудования, расходных материалов и инструментов

    Все работы с клеточным и тканевым материалом проводились в Лаборатории клеточных технологий ЦФПМБП МНТК МГ в соответствии с установленным санитарно-эпидемиологическим режимом. Для соблюдения асептических условий работу с материалом проводили в рабочем пространстве ламинарных боксов I и II классов безопасности.

    Все приборы и инструменты на момент проведения работ были откалиброваны согласно нормативам и подготовлены в соответствии с требованиями правил асептики. В таб. 7 представлено лабораторное оборудование, использованное в работе.

    Все использованные реактивы на момент проведения работ были стерильны и имели неистекший срок годности. В таб. 8 представлены использованные реактивы.

    Все использовавшиеся хирургические инструменты перед работой (разд. 2.1, 2.5) стерилизовались в Центре стерилизации оборудования МНТК МГ методом автоклавирования при температуре 121° С в течение 120 минут (таб. 9).

    Вся использованная лабораторная посуда была одноразовой, стерильной, и имела неистекший срок годности. В таб. 10 представлена использовавшаяся лабораторная посуда.


Страница источника: 50

XVII Всероссийская школа офтальмологаXVII Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018 ХVI Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научн...

 ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества

Сателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Росс...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Эндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференцияЭндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенациональн...

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Рейтинг@Mail.ru