Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

2.6.Лабораторные материалы и методы исследования


1----------

     2.6.1. Нормотермическое культивирование

    Под стандартными условиями инкубации понимали постоянно поддерживаемые температурный режим 37°С и концентрацию CO2 5%, что позволяло поддерживать оптимальное значение pH=7,4 в культурах при использовании питательной среды DMEM/F12 [21].

    Для клеточного и органного культивирования использовали полную питательную среду DMEM/F12 (89 об. %) с добавлением сухого L-глутамина, FBS (10 об. %) и смеси антибиотиков (1 об. %). Питательная среда указанного состава широко используется при нормотермическом культивировании как клеточных культур РПЭ, так и органных культур собственно сосудистой оболочки и ХПК [120, 270, 258, 96, 294]. Смену среды проводили каждые 3-4 дня или ранее при обнаружении отклонений pH от 7,4. Среда содержала индикатор феноловый красный, цвет которого позволяет судить о сдвигах кислотности. В таб. 6 приведена цветовая схема индикатора.

    2.6.2. Криоконсервация/дефростация

     Поскольку второй и третий, а также третий и четвертый-пятый этапы работы были значительно разнесены по времени (результаты второго этапа определяли методику проведения третьего, а по результатам третьего этапа проводили четвертый и пятый), а все использованные в работе культуры клеток являлись неиммортализованными (имели ограниченный пролиферативный потенциал), для предотвращения их преждевременного пролиферативного старения каждая культура подвергалась процедуре криоконсервации на втором и третьем этапах сразу после отбора клеток для 3D культивирования. По получении результатов третьего этапа работы культуры дефростировали и использовали для получения висячих капель на четвертом и пятом этапах работы, которые выполнялись параллельно. Таким образом, на всех этапах удалось использовать близкие генерации клеток одних и тех же культур, так что каждая клеточная культура перевивалась не более 10 раз. Методика криоконсервации в температурном режиме -80 ° С позволяет сохранять жизнеспособность клеткок РПЭ сроком до 6 недель [90]. Без использования метода криоконсервации при непрерывном нормотермическом ведении клеточных культур в течение нескольких месяцев неиммортализованные клеточные культуры достигают пролиферативного предела Хейфлика (~50 клеточных генераций), после чего наступает апоптоз вследствие постепенного необратимого укорочения теломер хромосом делящихся клеток [16].

    Криоконсервация прооводилась по стандартной методике. Клетки извлекали из чашки Петри после их инкубации со смесью 0,25% раствора трипсина и раствора Версена (1:1) в стандартных условиях в течение 10 минут, центрифунировали в режиме 1800 об./мин. в течение 5 минут, сливали супернатант, а осадок ресуспендировали в 1 мл смеси диметилсульфоксида и FBS (10/90 % по объему, соответственно). Полученную суспензию переносили в криопробирку 1,5 мл и замораживали при температурном режиме -80° С.

    Для дефростации замороженную пробирку размораживали при 37°С в течение 5 минут, содержимое разбавляли 5 мл DMEM/F12, центрифугировали в режиме 1800 об./мин. в течение 5 минут, супернатант сливали, а осадок разбавляли 2 мл питательной среды и переносили в чашку Петри (35 мм).

    2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток

    Для оценки жизнеспособности клеточного материала на всех этапах работы использовали тест с трипановым синим. Образец суспензии клеток объемом 5 мкл смешивали с 5 мкл 0,4% трипанового синего, выдерживали в течение 1-2 минут, после чего производили подсчет жизнеспособных (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных) клеток при помощи камеры Горяева [21, 116].

     2.6.4. Перечень использованного лаборораторного оборудования, расходных материалов и инструментов

    Все работы с клеточным и тканевым материалом проводились в Лаборатории клеточных технологий ЦФПМБП МНТК МГ в соответствии с установленным санитарно-эпидемиологическим режимом. Для соблюдения асептических условий работу с материалом проводили в рабочем пространстве ламинарных боксов I и II классов безопасности.

    Все приборы и инструменты на момент проведения работ были откалиброваны согласно нормативам и подготовлены в соответствии с требованиями правил асептики. В таб. 7 представлено лабораторное оборудование, использованное в работе.

    Все использованные реактивы на момент проведения работ были стерильны и имели неистекший срок годности. В таб. 8 представлены использованные реактивы.

    Все использовавшиеся хирургические инструменты перед работой (разд. 2.1, 2.5) стерилизовались в Центре стерилизации оборудования МНТК МГ методом автоклавирования при температуре 121° С в течение 120 минут (таб. 9).

    Вся использованная лабораторная посуда была одноразовой, стерильной, и имела неистекший срок годности. В таб. 10 представлена использовавшаяся лабораторная посуда.


Страница источника: 50
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru