Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

2.2.Второй этап. Подготовка ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования


1----------

     Сегодня имеются различные технические способы культивирования клеток для получения сфероидов – культивирование на вязких питательных средах [165, 235], на гидрофобных поверхностях [80], внутри пористых материалов [128], при механической ротации культурального сосуда [289], при культивировании клеточной суспензии в микролунках с неадгезивным покрытием [250]. Несмотря на наличие в литературе единичных упоминаний о формировании сфероидов РПЭ с целью изучения его биологии [235], не удалось найти данных о трехмерном культивировании донорского РПЭ с целью его подготовки к трансплантации, а именно – нет никаких рекомендаций относительно оптимальных посевных количеств клеток РПЭ в одном сфероиде и оптимальных сроков 3D культивирования, что позволило сформулировать вторую задачу исследования.

    2.2.1. Первичное 2D культивирование ретинального пигментного эпителия

    При 3D культивировании зрелых соматических клеток традиционно используют клеточный материал, предварительно культивированный на плоскости (в 2D). Культивирование 2D выполняет две функции: позволяет получить достаточное для дальнейших экспериментов количество клеток, а также способствует стабилизации или деградации культуры, в зависимости от количества и энергетического потенциала клеток в первичной культуре, т.е. играет роль естественного теста жизнеспособности донорского материала. Для второго этапа использовали суспензии клеток РПЭ, полученные в опытной группе на первом этапе работы (11 суспензий – по одной из каждого донорского глазного яблока, рассмотрено раздел 2.1.1).

    Суспензию клеток центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок разбавляли 2 мл питательной среды на основе полной ростовой среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему с L-глутамином (DMEM/F12; 89% об.) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Fetal bovine serum, FBS; 10 % об.), смеси антибиотиков (1,0 % об.). Количество клеток 40 подсчитывали в камере Горяева, отмеряли количество суспензии, содержащее 0,3х106 клеток РПЭ (таб. 4) и переносили в чашку Петри (35 мм), поверхность которой была предварительно смочена FBS. Чашку Петри накрывали крышкой и инкубировали в стандартных условиях. Первую смену питательной среды проводили спустя 10 дней культивирования, далее - каждые 3-4 дня. Таким образом получали первичную клеточную культуру т.н. нулевого пассажа, P0.

    Иммуногистохимическое исследование первичной культуры РПЭ

    Для молекулярной идентификации первичных клеточных культур часть клеточной суспензии при пассировании переносили на адгезивные стекла и культивировали внутри чашек Петри (35 мм) в стандартных условиях в течение 2 суток, после чего проводили иммуногистохимическое окрашивание на ряд специфических белковых маркеров – RPE65, ZO-1, E-cadherin и виментин.

    RPE65 – специфический фермент клеток РПЭ массой 65 кДа, один из ключевых белков зрительного цикла. Располагается преимущественно в мембране гладкого эндоплазматического ретикулума (Kiser PD, Palczewski K, 2010).

    Плотные межклеточные контакты – близко расположенные области двух клеток, чьи мембраны соединяются вместе, формируя практически непроницаемый барьер для жидкостей [210]. Плотные контакты наиболее выражены в эпителиальных тканях, в том числе в пигментном слое сетчатой оболочки. ZO-1 и E-кадгерин являются компонентами плотных межклеточных контактов, широко использующихся при иммуногистохимическом маркировании клеток РПЭ.

    ZO (лат. zonula occludens) – семейство белков, входящих в состав плотных межклеточных контактов, располагающихся с внутренней стороны плазматической мембраны и соединяющих область плотного контакта с элементами цитоскелета клетки. ZO-1 – белок семейства ZO, типичный для клеток РПЭ [210].

    Кадгерины (англ. Cadherins, «Ca 2+ -dependent adhesion») – семейство гликопротеинов, которые опосредуют кальций-зависимую межклеточную адгезию в точках соединения клеток и участвуют в сложных сигнальных путях, затрагивающих клеточный фенотип. Превалирующий тип кадгерина может отличаться в зависимости от типа ткани. E-кадгерин является основным кадгерином большинства монослоев эпителиальных клеток и в клетках РПЭ располагается рассеянными группами на стыках клеток и маркером эпителиального состояния клеток [51].

    Виментин – белок промежуточных филаментов III типа, основной компонент цитоскелета мезенхимальных клеток; увеличение количества виментина служит маркером эпителиально-мезенхимального перехода.

    Окрашенные клеточные культуры изучали на конфокальном микроскопе. Результаты иммуногистохимических исследований 2D культур представлены в разд. 3.2.1.

    2.2.2. Клеточное 2D субкультивирование ретинального пигментного эпителия

    Клетки РПЭ, будучи дезагрегированными из естественной тканевой ниши и первично культивируемые, проходят стандартные начальные фазы культурального роста – lag-фазу (фазу адаптации, в течение 2-3 недель) и log-фазу (фазу экспоненциального роста). Как только эпителиальные клетки начинают контактировать друг с другом (слияние, конфлюэнция), экспрессируя белки межклеточной адгезии, клеточное деление замедляется, и культура выходит на фазу плато [21].

    Суммарное количество клеток РПЭ в глазу взрослого человека составляет от 2 до 4х106 клеток [209]. Количество клеток РПЭ, которые можно выделить из трупного глаза с приемлемым уровнем их жизнеспособности, составляет менее 1*106 [295]. Целью субкультивирования является поддержание пролиферативного потенциала клеточной культуры и наращивание достаточного для экспериментальной работы количества клеток. Минимальное количество клеток в каждой 2D культуре перед проведением трехмерного культивирования должно было составлять 2,5х106 клеток (см. разд. 2.2.3. и разд. 3.2.2.), в то время как количество клеток в конфлюэнтной культуре на дне большой чашки Петри (10 см) в конце этапа субкультивирования может достигать 8,8*106 (таб. 4).

    На 3-й--4-й неделях первичного культивирования по достижении клеточным слоем в первичной культуре 80-90% конфлюэнтности проводили первое пассирование культуры – питательную среду заменяли смесью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и раствора Версена (1:1 по объему) и инкубировали в стандартных условиях в течение 5-10 минут; суспензию отделившихся от субстрата клеток переносили в центрифужную пробирку, в которую для нейтрализации ферментативной смеси добавляли 1 мл FBS, и центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляли. Осадок разбавляли 2 мл питательной среды и переносили на чистую чашку Петри (35 мм). Образец суспензии объемом 20 мкл использовали для подсчета клеток в камере Горяева. Смену питательной среды проводили каждые 2-3 дня; последующие циклы пассирования-культивирования – каждые 7 дней до получения устойчивого конфлюэнтного монослоя в чашках Петри большего диаметра (100 мм), что позволяло за 5-6 пассажей (культуры P5-P6) увеличивать количество клеток до 5*106 и более клеток.

    Иммуногистохимическое исследование пассированных клеточных культур РПЭ

    Для отслеживания изменений клеточного фенотипа при клеточном субкультивировании клетки пассажей P5-P6 исследовали на те же иммуногистохимические маркеры, что и при изучении первичной культуры, -RPE-65, ZO-1, E-кадгерин и виментин – по той же методике (разд. 2.2.1). Окрашенные клеточные культуры изучали на конфокальном микроскопе. Результаты иммуногистохимических исследований 2D культур представлены в разд. 3.2.1.

    2.2.3. Трехмерное клеточное культивирование

    Разработка оригинальной техники подготовки клеток РПЭ к трансплантации методом 3D клеточного культивирования описана в разделе 3.2.2.

    По разработанной методике было получено 880 висячих капель (3D культур РПЭ) объемом 20 мкл каждая. За динамикой формирования сфероидов внутри висячих капель следили ежедневно с помощью инвертированного микроскопа в течение 28 дней, давая качественную оценку наблюдаемым явлениям, а также фотографируя содержимое капель на 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 сутки, производя затем измерения диаметра формирующихся микроагрегатов (о технике измерений см. в разделе 2.7), что давало основание судить о степени их созревания.

    Иммуногистохимическое исследование сфероидов РПЭ

    Для иммуногистохимического исследования отдельно формировали сфероиды в количестве 100-200 штук различной морфологии (см. разд. 3.2.3), фиксировали раствором 4% параформальдегида, наносили на поверхность адгезивного стекла, и окрашивали тем же набором иммуногистохимических маркеров, что и при исследовании 2D культур (см. разд. 2.2.1, 2.2.2), после чего окрашенные препараты исследовали на конфокальном микроскопе.


Страница источника: 38

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru