Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Оценка результатов изучения экспрессии генов и количественного определения цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба


1----------

     Определение локального цитокинового статуса в группе здоровых добровольцев

    Данные по определению локального цитокинового профиля (в конъюнктивальной полости) у здоровых индивидуумов в литературе единичны и основываются на определении веществ–цитокинов в слезной жидкости. Кроме того, опубликованы данные, что в нормальных условиях цитокины не продуцируются или продуцируются в минимальных концентрациях. Так же на результат диагностики цитокинов могут оказывать влияние различные факторы (общие и местные воспалительные процессы, наличие других офтальмологических заболеваний, перенесенные операции или травмы, метод и условия забора материала и др.). Только в одной отечественной научной работе [6] было уделено внимание детальному изучению локального цитокинового статуса у здоровых добровольцев путем изучения экспрессии генов (мРНК) 11-ти цитокинов (ИНФ-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-α) методом ОТ-ПЦР, а также исследовали содержание 9-ти цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ФНО-α, ГМ-КСФ) методом проточной флуометрии в клетках конъюнктивы. Учитывая другой набор тестовых систем для изучения как экспрессии генов цитокинов, так и самих веществ, а также применение других методов определения цитокинов в клетках конъюнктивальных соскобов, было принято решение о наборе группы здоровых добровольцев для определения нормальных контрольных данных.

    Качественную оценку, а именно наличие или отсутствие экспрессии генов 16 цитокинов (ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α) проводили с помощью метода ОТ-ПЦР путем определения их мРНК в клеточной культуре соскоба с конъюнктивы 30 здоровых добровольцев (30 глаз). В данную группу вошли 21 женщина (70 %) и 9 мужчин (30 %) в возрасте от 23-х до 35-ти лет (средний возраст 27,67 ± 3,44 лет). При этом у данной группы до взятия соскоба с конъюнктивы было проведено изучение микрофлоры в мазках с конъюнктивы, проведена биомикроскопия в день взятия мазка, собраны анамнестические данные. В итоге, у всех пациентов подтверждено отсутствие патологической микрофлоры в конъюнктивальной полости. При биомикроскопии не обнаружено признаков во спалительных процессов. Изучение анамнеза у всех обследуемых показало отсутствие общих острых и хронических процессов, отсутствие офтальмологических заболеваний, операций и травм глаз, отсутствие аномалий рефракции. При определении экспрессии генов цитокинов был получен либо положительный, либо отрицательный результат, в связи с чем результаты оценивали по количеству положительных ответов по каждому цитокину, выраженному в процентах (%). В результате в группе здоровых добровольцев была определена экспрессия генов ИФН-α и ИЛ-10 в 33,33 %, ИФН-β в 53,33 %, ИФН-λ2 в 46,67 %, ИЛ-6 в 36,67 %, ИЛ-8 в 16,67 %, ИЛ-12 – в 30 % и ФНО-α в 20 % случаев. Изучение экспрессии генов других цитокинов (ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-17, ИЛ-18) показало отрицательный результат (табл. 12).

    Количественную оценку проводили для 6 цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-α). Содержание цитокинов определяли в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы методом ИФА. Данный набор цитокинов был определен по результатам качественной оценки, так как определение наличия РНК именно этих цитокинов оказалось наиболее показательным как до, так и на фоне лечения.

    Кроме того, среди названных присутствуют как про-, так и противовоспалительные цитокины, а также противовирусный ИФН-α.

    В результате в исследуемых пробах отсутствовал ИЛ-10, количество других изучаемых цитокинов было определено и варьировало в широких предела в рамках группы каждого отдельного цитокина. Средние значения были следующие: ИФН-α – 2,92 ± 2,19 пкг/мл, ИЛ-2 – 2,81 ± 1,68 пкг/мл, ИЛ-4 – 2,24 ± 0,56 пкг/мл, ИЛ-6 – 0,76 ± 0,51 пкг/мл, ИЛ-8 – 8,13 ±5,35 пкг/мл (Табл. 13).

    Особенности локального цитокинового статуса в группе пациентов с рецидивирующим постаденовирусным поражением роговицы до начала терапии

    Для изучения особенностей местных иммунологических реакций у пациентов с развитием поражения роговицы в отдаленном периоде после перенесенного АВКК было проведено изучение экспрессии генов и самих цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба. Исследование было проведено у 30 пациентов (30 глаз) с постаденовирусным поражением роговицы в сроки 3 и более месяцев после острого аденовирусного процесса.

    При наличии бинокулярного поражения был выбран глаз с более выраженными изменениями. Необходимо отметить, что при биомикроскопии у данных пациентов отсутствовали признаки воспалительного процесса конъюнктивы, а при диагностике ДНК аденовируса в мазке с конъюнктивы получен отрицательный результат. При изучении локального цитокинового профиля не было поставлено цели отследить динамику изменений цитокинового статуса у одного и того же пациента. Согласно анализу литературных данных, на цитокиновый профиль могут оказывать влияние различные эндогенные и экзогенные факторы, поэтому была поставлена задача – изучить динамику состояния локального цитокинового статуса в небольшой популяции пациентов, исключая индивидуальные особенности.

    По результатам качественного анализа у пациентов до начала терапии были определены ИФН-α – в 70 %, ИФН-β – в 43,33 %, ИФН-γ – 16,67 %, ИЛ-8 – в 46,67 %, ИФН-λ2 и ИЛ-18 – в 13,33 % случаев. Матричная РНК цитокинов ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ФНО-α определена не была (табл. 12).

    Количественная оценка цитокинов с помощью метода ИФА в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы показала отсутствие ИЛ-10 у пациентов до начала терапии. При этом вариабельность результатов по другим цитокинам в данной группе также была высокой, как и в группе здоровых добровольцев. Средние показатели при определении самих веществ цитокинов следующие: ИФН-α – 3,43 ± 2,57 пкг/мл, ИЛ-2 – 2,03 ± 1,21 пкг/мл, ИЛ-4 – 3,69 ± 1,72 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,57 ± 1,93 пкг/мл, ИЛ-8 – 24,00±13,30 пкг/мл (табл. 13).

    При оценке иммунологического статуса у пациентов до лечения была отмечена статистически достоверно более высокая (в 2,1 раза), чем у здоровых лиц, продукция ИФН-α, что может свидетельствовать о том, что, несмотря на отсутствие клинических проявлений воспалительного процесса со стороны конъюнктивы, у пациентов, перенесших острый аденовирусный процесс 3 и более месяцев назад, сохраняется противовирусный иммунитет. Кроме того, продукция ИЛ-8, одного из острофазовых цитокинов, у пациентов до лечения была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц. Так же было отмечено, что у пациентов до лечения в надосадочной жидкости конъюнктивальных соскобов отмечено достоверное увеличение (в 1,65 раза) содержания противовоспалительного цитокина ИЛ-4, который является одним из активаторов гуморального звена иммунитета.

    Оценка динамики локального цитокинового статуса у пациентов с рецидивирующим постаденовирусным поражением роговицы на фоне терапии

    У пациентов с постаденовирусным рецидивирующим поражением роговицы в группах терапии I, II и IV были получены сходные по выраженности и срокам клинические результаты, что мы связываем с наличием во всех группах основного противовоспалительного вещества – дексаметазона. В группе III результаты в отдаленные сроки наблюдения отличались от таковых в других группах, что обусловлено длительным применением иммуномодулирующего лекарственного вещества – ЦсА.

    Учитывая эти данные, группы I и III были выбраны для проведения исследования по изучению локальных иммунологических особенностей. Для более объективной оценки изолированного влияния лекарственных препаратов забор материала (соскоб с конъюнктивы) для исследования в группах I и III производился на сроках 1 и 4 месяца (через 1 месяц после отмены кортикостероидов) от начала терапии. Время забора материала было выбрано, учитывая наличие в терапии всех пациентов в первые три месяца лечения основного действующего вещества – дексаметазона.

    В группе I (терапии кортикостероидами) исследование было проведено у 32 человек (32 глаза), как уже было отмечено, при бинокулярном поражении был выбран глаз с более выраженными изменениями. На сроке 1 месяц от начала терапии качественный тест выявил экспрессию генов следующих цитокинов: ИФН-α – в 50 %, ИФН-β – в 28,13 %, ИФН-γ – в 21,88 %, ИФН-λ2 – в 46,88 %, ИЛ-1β и ИЛ-2 – в 12,5 %, ИЛ-4 – в 15,63 %, ИЛ-6 – в 25 %, ИЛ-8 – в 34,38 % и ИЛ-10 – в 37,5 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α показало отрицательный результат у всех пациентов группы на данном этапе. При этом произошло статистически значимое увеличение количества случаев определения цитокинов ИФН-λ2, ИЛ-6 и ИЛ-10 (р<0,05) по сравнению с группой «До лечения» (табл. 12).

    На сроке 4 месяца были получены следующие результаты: ИФН-α – 65,63 %, ИФН-β – 46,88 %, ИФН-γ – 21,88 %, ИФН-λ2 – в 12,5 %, ИЛ-1β и ФНО-α – 6,25 %, ИЛ-2 – 3,13 %, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-17 – 9,38 %, ИЛ-8 – 40,63 %, ИЛ-18 – 12,5 % случаев. Отрицательный ответ получен при определении ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-4, ИЛ-12. Достоверных различий с группой «До лечения» выявлено не было ни по одному из показателей (р>0,05). При сравнении результатов на сроках 1 и 4 месяца – статистически значимое уменьшение произошло со стороны цитокинов ИФН-λ2 и ИЛ-10 (р<0,05) (табл. 12).

    Количественный анализ по определению цитокинов показал следующие результаты на сроке 1 месяц терапии: ИФН-α – 1,88 ± 1,41 пкг/мл, ИЛ-4 – 4,18 ± 1,97 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,33 ± 1,39 пкг/мл, ИЛ-8 – 45,30 ±18,07 пкг/мл. Цитокины ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистический анализ показал достоверное изменение (р<0,01) по сравнению с группой «До лечения» со стороны цитокинов ИЛ-2 (v) и ИЛ-8 (^) (табл. 13).

    На сроке 4 месяца от начала лечения цитокины были выявлены в количестве: ИФН-α – 3,15 ± 2,26 пкг/мл, ИЛ-2 – 1,85 ± 1,38 пкг/мл, ИЛ-4 – 4,06 ± 2,84 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,97 ± 1,78 пкг/мл, ИЛ-8 – 30,56 ± 16,81 пкг/мл. Цитокин ИЛ-10 выявлен не был. При этом показатели всех изучаемых интерлейкинов достоверно не отличались от здоровых индивидуумов, а различие результатов определения ИФН-α (^), ИЛ-2 (^) и ИЛ-8 (v) статистически значимо (р<0,01) по сравнению с таковыми на сроке 1 месяц терапии (табл. 13).

    В группе III (комбинированное лечение) было обследовано 33 человека (33 глаза). На сроке 1 месяц от начала лечения у пациентов была определена экспрессия генов цитокинов (качественная оценка): ИФН-α – в 45,45 %, ИФН-β – в 24,24 %, ИФН-γ – в 21,21 %, ИФН-λ2 – в 42,42 %, ИЛ-1β – 18,18 %, ИЛ-2 и ИЛ-4 – 15,15 %, ИЛ-6 – в 33,33 %, ИЛ-8 – в 30,3 %, ИЛ-10 – в 36,36 %, ИЛ-12 – 9,09 %– в 12,12 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-17, ИЛ-18 и ФНО-α показало отрицательный результат. Экспрессия генов цитокинов ИФН-λ2, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 на данном этапе статистически значимо увеличилась по сравнению с группой «До лечения» (табл. 12).

    На сроке 4 месяца терапии были получены следующие результаты определения экспрессии генов цитокинов: ИФН-α – в 60,06 %, ИФН-β – в 30,3 %, ИФН-γ и ИЛ-17 – в 6,06 %, ИФН-λ2 – в 24,24 %, ИЛ-1β и ИЛ-8 – в 9,09 %, ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНО-α – в 12,12 %, ИЛ-6 – в 39,39 %, ИЛ-10 – в 42,42 % и ИЛ-18 – в 21,21 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3 и ИЛ-12 показало отрицательный результат. При статистической оценке выявлена достоверная разница между экспрессией генов ИЛ-6 (^), ИЛ-8 (v) и ИЛ-10 (^) на сроке 4 месяца и в группе «До лечения». При этом по указанным цитокинам отличия от здоровых добровольцев не обнаружено. Статистически значимое увеличение по сравнение со сроком 1 месяц терапии произошло только с ИЛ-18.

    Определение цитокинов показало следующие количественные результаты на сроке 1 месяц терапии: ИФН-α – 2,06 ± 1,52 пкг/мл, ИЛ-4 – 3,81 ± 2,67 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,26 ± 1,47 пкг/мл, ИЛ-8 – 42,02 ± 27,31 пкг/мл.

    Цитокины ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистически достоверные изменения по сравнению с группой «До лечения» были выявлены со стороны ИФН-α (v, р<0,05), ИЛ-2 (v, р<0,01) и ИЛ-8 (^, р<0,01) (табл. 13).

    На сроке 4 месяца от начала лечения цитокины были определены в следующем количестве: ИЛ-4 – 5,01 ± 3,76 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,02 ±1,28 пкг/мл, ИЛ-8 – 20,02 ±11,97 пкг/мл. Цитокины ИФН-α, ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистический анализ показал достоверное уменьшение (р<0,01) количества ИФН-α и ИЛ-2 по сравнению с группой «До лечения» и достоверное снижение (р<0,01) количества ИФН-α и ИЛ-8 по сравнению со сроком 1 месяц терапии в данной группе (табл. 13).

    Как и в группах здоровых людей и пациентов до начала терапии, в группах I и III на фоне противовоспалительной терапии определяемые значения количества цитокинов в пробах варьировали в широких пределах.

    В группах I и III на фоне 1 месяца лечения с применением основного действующего вещества – дексаметазона – в обеих группах наблюдалось снижение уровня синтеза противовирусного ИФН-α (в 1,4 и 1,54 раза соответственно) до значений, достоверно не отличающихся от здоровых лиц (р < 0,05). В группе III у пациентов на фоне длительного применения комбинированной противовоспалительной терапии в течение 4х месяцев отмечается полное подавление продукции ИФН-α. При этом в обеих группах на фоне лечения отмечалось угнетение синтеза ИФН-α уже на посттранскрипционном уровне (табл. 13), так как уровень транскрипции этого цитокина в группах I и III оставался более высоким, чем у здоровых лиц (рис. 12).

    Достоверно увеличенное до лечения количество цитокина ИЛ-4 продолжало постепенно расти на фоне противовоспалительной терапии в обеих группах, что может косвенно свидетельствовать об активации гуморального иммунитета. Максимальное значение ИЛ-4 отмечено на сроке 4 месяца от начала терапии в группе III (комбинированное лечение).

    У всех пациентов в обеих группах наблюдалось угнетение продукции провоспалительного ИЛ-2 на фоне лечения, хотя уровень транскрипции этого цитокина соответствовал здоровым лицам. Так как ИЛ-2 является активатором Th-1–типа иммунного ответа, можно косвенно судить об угнетении клеточного звена иммунитета.

    Как уже было отмечено, у пациентов до лечения продукция одного из основных провоспалительных цитокинов ИЛ-8 была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц, что свидетельствует о преобладании воспалительной реакции до начала лечения. Причем, терапия дексаметазоном (группа I) способствовала активации синтеза ИЛ-8, что проявилось уже на уровне транскрипции. При этом экспрессия генов и содержание ИЛ-8 оставалось высоким даже после отмены лечения (контроль на сроке 4 месяца терапии).

    В группе III, где исследование проводилось на фоне комбинированной терапии, уровень транскрипции ИЛ-8 на сроке 4 месяца от начала терапии достоверно не отличался от показателя здоровых лиц. Показатели количественной оценки ИЛ-8 в данной группе так же подвергались постепенному снижению.

    Соответственно, на фоне монотерапии дексаметазоном не происходило стабилизации процесса, а у пациентов группы III, к оторые получали более длительное противовоспалительное лечение с включением препарата 0,05% ЦсА, восстановление уровня ИЛ-8 до значений, сравнимых с таковыми у здоровых лиц, свидетельствует о постепенном восстановлении баланса про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне.

    Таким образом, наилучшие клинико-функциональные результаты в группе III (схема терапии с применением официнального препарата 0,05 % циклоспорина А) были подтверждены иммунологическими параметрами, а именно, на фоне лечения произошло полное подавление продукции ИФН-α; усиление активности регулятора гуморального иммунитета (плавное увеличение количества ИЛ-4); снижение концентрации провоспалительного ИЛ-2, активатора клеточного звена иммунитета, вплоть до полного его подавления. Кроме того, отмечалось восстановление уровня транскрипции провоспалительного цитокина ИЛ-8 до значений, достоверно не отличающегося от таковых у здоровых лиц, так же плавное снижение количественного содержания цитокина. Полученные данные свидетельствуют о постепенном восстановлении нарушенного до лечения баланса про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне.


Страница источника: 88
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru