Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Оценка результатов изучения экспрессии генов и количественного определения цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба


1----------

     Определение локального цитокинового статуса в группе здоровых добровольцев

    Данные по определению локального цитокинового профиля (в конъюнктивальной полости) у здоровых индивидуумов в литературе единичны и основываются на определении веществ–цитокинов в слезной жидкости. Кроме того, опубликованы данные, что в нормальных условиях цитокины не продуцируются или продуцируются в минимальных концентрациях. Так же на результат диагностики цитокинов могут оказывать влияние различные факторы (общие и местные воспалительные процессы, наличие других офтальмологических заболеваний, перенесенные операции или травмы, метод и условия забора материала и др.). Только в одной отечественной научной работе [6] было уделено внимание детальному изучению локального цитокинового статуса у здоровых добровольцев путем изучения экспрессии генов (мРНК) 11-ти цитокинов (ИНФ-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-α) методом ОТ-ПЦР, а также исследовали содержание 9-ти цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ФНО-α, ГМ-КСФ) методом проточной флуометрии в клетках конъюнктивы. Учитывая другой набор тестовых систем для изучения как экспрессии генов цитокинов, так и самих веществ, а также применение других методов определения цитокинов в клетках конъюнктивальных соскобов, было принято решение о наборе группы здоровых добровольцев для определения нормальных контрольных данных.

    Качественную оценку, а именно наличие или отсутствие экспрессии генов 16 цитокинов (ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α) проводили с помощью метода ОТ-ПЦР путем определения их мРНК в клеточной культуре соскоба с конъюнктивы 30 здоровых добровольцев (30 глаз). В данную группу вошли 21 женщина (70 %) и 9 мужчин (30 %) в возрасте от 23-х до 35-ти лет (средний возраст 27,67 ± 3,44 лет). При этом у данной группы до взятия соскоба с конъюнктивы было проведено изучение микрофлоры в мазках с конъюнктивы, проведена биомикроскопия в день взятия мазка, собраны анамнестические данные. В итоге, у всех пациентов подтверждено отсутствие патологической микрофлоры в конъюнктивальной полости. При биомикроскопии не обнаружено признаков во спалительных процессов. Изучение анамнеза у всех обследуемых показало отсутствие общих острых и хронических процессов, отсутствие офтальмологических заболеваний, операций и травм глаз, отсутствие аномалий рефракции. При определении экспрессии генов цитокинов был получен либо положительный, либо отрицательный результат, в связи с чем результаты оценивали по количеству положительных ответов по каждому цитокину, выраженному в процентах (%). В результате в группе здоровых добровольцев была определена экспрессия генов ИФН-α и ИЛ-10 в 33,33 %, ИФН-β в 53,33 %, ИФН-λ2 в 46,67 %, ИЛ-6 в 36,67 %, ИЛ-8 в 16,67 %, ИЛ-12 – в 30 % и ФНО-α в 20 % случаев. Изучение экспрессии генов других цитокинов (ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-17, ИЛ-18) показало отрицательный результат (табл. 12).

    Количественную оценку проводили для 6 цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-α). Содержание цитокинов определяли в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы методом ИФА. Данный набор цитокинов был определен по результатам качественной оценки, так как определение наличия РНК именно этих цитокинов оказалось наиболее показательным как до, так и на фоне лечения.

    Кроме того, среди названных присутствуют как про-, так и противовоспалительные цитокины, а также противовирусный ИФН-α.

    В результате в исследуемых пробах отсутствовал ИЛ-10, количество других изучаемых цитокинов было определено и варьировало в широких предела в рамках группы каждого отдельного цитокина. Средние значения были следующие: ИФН-α – 2,92 ± 2,19 пкг/мл, ИЛ-2 – 2,81 ± 1,68 пкг/мл, ИЛ-4 – 2,24 ± 0,56 пкг/мл, ИЛ-6 – 0,76 ± 0,51 пкг/мл, ИЛ-8 – 8,13 ±5,35 пкг/мл (Табл. 13).

    Особенности локального цитокинового статуса в группе пациентов с рецидивирующим постаденовирусным поражением роговицы до начала терапии

    Для изучения особенностей местных иммунологических реакций у пациентов с развитием поражения роговицы в отдаленном периоде после перенесенного АВКК было проведено изучение экспрессии генов и самих цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба. Исследование было проведено у 30 пациентов (30 глаз) с постаденовирусным поражением роговицы в сроки 3 и более месяцев после острого аденовирусного процесса.

    При наличии бинокулярного поражения был выбран глаз с более выраженными изменениями. Необходимо отметить, что при биомикроскопии у данных пациентов отсутствовали признаки воспалительного процесса конъюнктивы, а при диагностике ДНК аденовируса в мазке с конъюнктивы получен отрицательный результат. При изучении локального цитокинового профиля не было поставлено цели отследить динамику изменений цитокинового статуса у одного и того же пациента. Согласно анализу литературных данных, на цитокиновый профиль могут оказывать влияние различные эндогенные и экзогенные факторы, поэтому была поставлена задача – изучить динамику состояния локального цитокинового статуса в небольшой популяции пациентов, исключая индивидуальные особенности.

    По результатам качественного анализа у пациентов до начала терапии были определены ИФН-α – в 70 %, ИФН-β – в 43,33 %, ИФН-γ – 16,67 %, ИЛ-8 – в 46,67 %, ИФН-λ2 и ИЛ-18 – в 13,33 % случаев. Матричная РНК цитокинов ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ФНО-α определена не была (табл. 12).

    Количественная оценка цитокинов с помощью метода ИФА в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы показала отсутствие ИЛ-10 у пациентов до начала терапии. При этом вариабельность результатов по другим цитокинам в данной группе также была высокой, как и в группе здоровых добровольцев. Средние показатели при определении самих веществ цитокинов следующие: ИФН-α – 3,43 ± 2,57 пкг/мл, ИЛ-2 – 2,03 ± 1,21 пкг/мл, ИЛ-4 – 3,69 ± 1,72 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,57 ± 1,93 пкг/мл, ИЛ-8 – 24,00±13,30 пкг/мл (табл. 13).

    При оценке иммунологического статуса у пациентов до лечения была отмечена статистически достоверно более высокая (в 2,1 раза), чем у здоровых лиц, продукция ИФН-α, что может свидетельствовать о том, что, несмотря на отсутствие клинических проявлений воспалительного процесса со стороны конъюнктивы, у пациентов, перенесших острый аденовирусный процесс 3 и более месяцев назад, сохраняется противовирусный иммунитет. Кроме того, продукция ИЛ-8, одного из острофазовых цитокинов, у пациентов до лечения была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц. Так же было отмечено, что у пациентов до лечения в надосадочной жидкости конъюнктивальных соскобов отмечено достоверное увеличение (в 1,65 раза) содержания противовоспалительного цитокина ИЛ-4, который является одним из активаторов гуморального звена иммунитета.

    Оценка динамики локального цитокинового статуса у пациентов с рецидивирующим постаденовирусным поражением роговицы на фоне терапии

    У пациентов с постаденовирусным рецидивирующим поражением роговицы в группах терапии I, II и IV были получены сходные по выраженности и срокам клинические результаты, что мы связываем с наличием во всех группах основного противовоспалительного вещества – дексаметазона. В группе III результаты в отдаленные сроки наблюдения отличались от таковых в других группах, что обусловлено длительным применением иммуномодулирующего лекарственного вещества – ЦсА.

    Учитывая эти данные, группы I и III были выбраны для проведения исследования по изучению локальных иммунологических особенностей. Для более объективной оценки изолированного влияния лекарственных препаратов забор материала (соскоб с конъюнктивы) для исследования в группах I и III производился на сроках 1 и 4 месяца (через 1 месяц после отмены кортикостероидов) от начала терапии. Время забора материала было выбрано, учитывая наличие в терапии всех пациентов в первые три месяца лечения основного действующего вещества – дексаметазона.

    В группе I (терапии кортикостероидами) исследование было проведено у 32 человек (32 глаза), как уже было отмечено, при бинокулярном поражении был выбран глаз с более выраженными изменениями. На сроке 1 месяц от начала терапии качественный тест выявил экспрессию генов следующих цитокинов: ИФН-α – в 50 %, ИФН-β – в 28,13 %, ИФН-γ – в 21,88 %, ИФН-λ2 – в 46,88 %, ИЛ-1β и ИЛ-2 – в 12,5 %, ИЛ-4 – в 15,63 %, ИЛ-6 – в 25 %, ИЛ-8 – в 34,38 % и ИЛ-10 – в 37,5 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α показало отрицательный результат у всех пациентов группы на данном этапе. При этом произошло статистически значимое увеличение количества случаев определения цитокинов ИФН-λ2, ИЛ-6 и ИЛ-10 (р<0,05) по сравнению с группой «До лечения» (табл. 12).

    На сроке 4 месяца были получены следующие результаты: ИФН-α – 65,63 %, ИФН-β – 46,88 %, ИФН-γ – 21,88 %, ИФН-λ2 – в 12,5 %, ИЛ-1β и ФНО-α – 6,25 %, ИЛ-2 – 3,13 %, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-17 – 9,38 %, ИЛ-8 – 40,63 %, ИЛ-18 – 12,5 % случаев. Отрицательный ответ получен при определении ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-4, ИЛ-12. Достоверных различий с группой «До лечения» выявлено не было ни по одному из показателей (р>0,05). При сравнении результатов на сроках 1 и 4 месяца – статистически значимое уменьшение произошло со стороны цитокинов ИФН-λ2 и ИЛ-10 (р<0,05) (табл. 12).

    Количественный анализ по определению цитокинов показал следующие результаты на сроке 1 месяц терапии: ИФН-α – 1,88 ± 1,41 пкг/мл, ИЛ-4 – 4,18 ± 1,97 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,33 ± 1,39 пкг/мл, ИЛ-8 – 45,30 ±18,07 пкг/мл. Цитокины ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистический анализ показал достоверное изменение (р<0,01) по сравнению с группой «До лечения» со стороны цитокинов ИЛ-2 (v) и ИЛ-8 (^) (табл. 13).

    На сроке 4 месяца от начала лечения цитокины были выявлены в количестве: ИФН-α – 3,15 ± 2,26 пкг/мл, ИЛ-2 – 1,85 ± 1,38 пкг/мл, ИЛ-4 – 4,06 ± 2,84 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,97 ± 1,78 пкг/мл, ИЛ-8 – 30,56 ± 16,81 пкг/мл. Цитокин ИЛ-10 выявлен не был. При этом показатели всех изучаемых интерлейкинов достоверно не отличались от здоровых индивидуумов, а различие результатов определения ИФН-α (^), ИЛ-2 (^) и ИЛ-8 (v) статистически значимо (р<0,01) по сравнению с таковыми на сроке 1 месяц терапии (табл. 13).

    В группе III (комбинированное лечение) было обследовано 33 человека (33 глаза). На сроке 1 месяц от начала лечения у пациентов была определена экспрессия генов цитокинов (качественная оценка): ИФН-α – в 45,45 %, ИФН-β – в 24,24 %, ИФН-γ – в 21,21 %, ИФН-λ2 – в 42,42 %, ИЛ-1β – 18,18 %, ИЛ-2 и ИЛ-4 – 15,15 %, ИЛ-6 – в 33,33 %, ИЛ-8 – в 30,3 %, ИЛ-10 – в 36,36 %, ИЛ-12 – 9,09 %– в 12,12 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3, ИЛ-17, ИЛ-18 и ФНО-α показало отрицательный результат. Экспрессия генов цитокинов ИФН-λ2, ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 на данном этапе статистически значимо увеличилась по сравнению с группой «До лечения» (табл. 12).

    На сроке 4 месяца терапии были получены следующие результаты определения экспрессии генов цитокинов: ИФН-α – в 60,06 %, ИФН-β – в 30,3 %, ИФН-γ и ИЛ-17 – в 6,06 %, ИФН-λ2 – в 24,24 %, ИЛ-1β и ИЛ-8 – в 9,09 %, ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНО-α – в 12,12 %, ИЛ-6 – в 39,39 %, ИЛ-10 – в 42,42 % и ИЛ-18 – в 21,21 % случаев. Исследование экспрессии ИФН-λ1, ИФН-λ3 и ИЛ-12 показало отрицательный результат. При статистической оценке выявлена достоверная разница между экспрессией генов ИЛ-6 (^), ИЛ-8 (v) и ИЛ-10 (^) на сроке 4 месяца и в группе «До лечения». При этом по указанным цитокинам отличия от здоровых добровольцев не обнаружено. Статистически значимое увеличение по сравнение со сроком 1 месяц терапии произошло только с ИЛ-18.

    Определение цитокинов показало следующие количественные результаты на сроке 1 месяц терапии: ИФН-α – 2,06 ± 1,52 пкг/мл, ИЛ-4 – 3,81 ± 2,67 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,26 ± 1,47 пкг/мл, ИЛ-8 – 42,02 ± 27,31 пкг/мл.

    Цитокины ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистически достоверные изменения по сравнению с группой «До лечения» были выявлены со стороны ИФН-α (v, р<0,05), ИЛ-2 (v, р<0,01) и ИЛ-8 (^, р<0,01) (табл. 13).

    На сроке 4 месяца от начала лечения цитокины были определены в следующем количестве: ИЛ-4 – 5,01 ± 3,76 пкг/мл, ИЛ-6 – 2,02 ±1,28 пкг/мл, ИЛ-8 – 20,02 ±11,97 пкг/мл. Цитокины ИФН-α, ИЛ-2 и ИЛ-10 выявлены не были. Статистический анализ показал достоверное уменьшение (р<0,01) количества ИФН-α и ИЛ-2 по сравнению с группой «До лечения» и достоверное снижение (р<0,01) количества ИФН-α и ИЛ-8 по сравнению со сроком 1 месяц терапии в данной группе (табл. 13).

    Как и в группах здоровых людей и пациентов до начала терапии, в группах I и III на фоне противовоспалительной терапии определяемые значения количества цитокинов в пробах варьировали в широких пределах.

    В группах I и III на фоне 1 месяца лечения с применением основного действующего вещества – дексаметазона – в обеих группах наблюдалось снижение уровня синтеза противовирусного ИФН-α (в 1,4 и 1,54 раза соответственно) до значений, достоверно не отличающихся от здоровых лиц (р < 0,05). В группе III у пациентов на фоне длительного применения комбинированной противовоспалительной терапии в течение 4х месяцев отмечается полное подавление продукции ИФН-α. При этом в обеих группах на фоне лечения отмечалось угнетение синтеза ИФН-α уже на посттранскрипционном уровне (табл. 13), так как уровень транскрипции этого цитокина в группах I и III оставался более высоким, чем у здоровых лиц (рис. 12).

    Достоверно увеличенное до лечения количество цитокина ИЛ-4 продолжало постепенно расти на фоне противовоспалительной терапии в обеих группах, что может косвенно свидетельствовать об активации гуморального иммунитета. Максимальное значение ИЛ-4 отмечено на сроке 4 месяца от начала терапии в группе III (комбинированное лечение).

    У всех пациентов в обеих группах наблюдалось угнетение продукции провоспалительного ИЛ-2 на фоне лечения, хотя уровень транскрипции этого цитокина соответствовал здоровым лицам. Так как ИЛ-2 является активатором Th-1–типа иммунного ответа, можно косвенно судить об угнетении клеточного звена иммунитета.

    Как уже было отмечено, у пациентов до лечения продукция одного из основных провоспалительных цитокинов ИЛ-8 была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц, что свидетельствует о преобладании воспалительной реакции до начала лечения. Причем, терапия дексаметазоном (группа I) способствовала активации синтеза ИЛ-8, что проявилось уже на уровне транскрипции. При этом экспрессия генов и содержание ИЛ-8 оставалось высоким даже после отмены лечения (контроль на сроке 4 месяца терапии).

    В группе III, где исследование проводилось на фоне комбинированной терапии, уровень транскрипции ИЛ-8 на сроке 4 месяца от начала терапии достоверно не отличался от показателя здоровых лиц. Показатели количественной оценки ИЛ-8 в данной группе так же подвергались постепенному снижению.

    Соответственно, на фоне монотерапии дексаметазоном не происходило стабилизации процесса, а у пациентов группы III, к оторые получали более длительное противовоспалительное лечение с включением препарата 0,05% ЦсА, восстановление уровня ИЛ-8 до значений, сравнимых с таковыми у здоровых лиц, свидетельствует о постепенном восстановлении баланса про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне.

    Таким образом, наилучшие клинико-функциональные результаты в группе III (схема терапии с применением официнального препарата 0,05 % циклоспорина А) были подтверждены иммунологическими параметрами, а именно, на фоне лечения произошло полное подавление продукции ИФН-α; усиление активности регулятора гуморального иммунитета (плавное увеличение количества ИЛ-4); снижение концентрации провоспалительного ИЛ-2, активатора клеточного звена иммунитета, вплоть до полного его подавления. Кроме того, отмечалось восстановление уровня транскрипции провоспалительного цитокина ИЛ-8 до значений, достоверно не отличающегося от таковых у здоровых лиц, так же плавное снижение количественного содержания цитокина. Полученные данные свидетельствуют о постепенном восстановлении нарушенного до лечения баланса про- и противовоспалительных цитокинов на локальном уровне.


Страница источника: 88

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru