Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Лабораторные методы исследования


1----------

    Оценка наличия вирусного инфицирования

    Для изучения наличия или отсутствия аденовируса у пациентов на разных стадиях течения пленчатой формы АВКК проводилось качественное (+/-) исследование ДНК аденовируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в мазках с конъюнктивы. Исследование проводилось на базе КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, г. Москва. Для проведения исследования были набраны две группы пациентов (65 человек). В первую группу были отобраны 45 человек с острой пленчатой формой АВКК, у которых исследование проводили на этапах 1-3 сутки, 10-14 сутки, 1 месяц и 3 месяца от начала заболевания с целью определения наличия аденовируса на разных этапах развития и лечения заболевания. Пленчатая форма АВКК была выбрана для динамического определения ДНК аденовируса, как наиболее тяжелый вариант течения процесса. Так же выбор связан с характерной стадийностью клинического течения заболевания у пациентов с данной патологией. Одной из стадий при этом является инфильтративное поражение роговицы в исходе острого периода заболевания.

    Кроме того, ПЦР диагностику ДНК аденовируса проводили 20-ти пациентам с повторным формированием постаденовирусного поражения роговицы в отдаленные сроки после перенесенного острого периода АВКК в условиях отсутствия воспалительной реакции со стороны конъюнктивы. В данной группе исследование проводили в следующие сроки: до начала лечения, а также на сроках 1 и 3 месяца от начала лечения (при наличии положительного результата при первичной диагностике) (см. красный сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Исследование проводили с помощью набора реагентов для амплификации ДНК аденовируса с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле («АмплиСенс Adenovirus-EPh», Россия). Забор материала проводили с помощью стерильного зонда и помещали в транспортную среду при температуре 2-8°С. В лизирующий раствор, прогретый до температуры 65 °С, вносили 50 мкл пробы. Затем его подвергали центрифугированию (5 тыс. об/мин) на микроцентрифуге в течение 5 секунд. После добавления сорбента универсального и перемешивания проводили его осаждение путем центрифугирования.

    Полученные пробы подвергали двукратной процедуре отмывки и центрифугирования с удалением надосадочной жидкости. Затем пробирки помещали в термостат на 5 минут при температуре 65 °С для подсушивания сорбента. В пробирки добавляли ТЕ-буфер для эволюции ДНК, прогревали до 65 °С и подвергали центрифугированию в течение 1 минуты. Полученную надосадочную жидк ость использовали для определения ДНК аденовируса.

    Пробирки с пробами помещали в амплификатор на режиме паузы в момент достижения температуры в ячейках 95 °С. Время амплификации составило 2 часа, после чего полученный раствор помещали в заранее подготовленные лунки агарозного геля и подвергали элетрофорезу в течение 18-20 минут при напряжении 250В со стабилизацией по напряжению. Результаты ПЦР диагностики оценивали по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

    Оценка системного аутоиммунного ответа

    С целью оценки системного аутоиммунного ответа было проведено исследование крови на аутосенсибилизацию к антигенам роговицы пациентов с инфильтративным поражением роговицы после перенесенного АВКК. Для этого была отобрана группа пациентов с упорным рецидивированием поражения роговицы вне зависимости от проводимой терапии (10 пациентов) (см. розовый сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Исследование проводилось на базе лаборатории иммунологии, вирусологии и микробиологии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца».

    Системный (клеточный) иммунный ответ на антигены роговицы оценивали с помощью реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в капиллярном тесте. Количественный учет результатов РТМЛ производили по индексу миграции (ИМ), который представляет соотношение площадей миграции лейкоцитов в опытном экземпляре, где проверяли реакцию с антигеном, и в контрольном варианте, который представлен в виде среды RPMI 1640 «Sigma» без добавления антигена. Исходя из ранее накопленных данных лаборатории иммунологии и вирусологии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца», при оценке результатов за норму принимали интервал ИМ от 0,80 до 1,20. При этом показатели ниже 0,80 расценивали как «торможение» миграции лейкоцитов, а данные выше 1,20 – как «стимуляцию» миграции лейкоцитов. Оба типа ответа считали положительной реакцией, отражавшей системную аутосенсибилизацию больного.

    Оценка локального цитокинового статуса

    В группах с наиболее значимыми клиническими результатами терапии постаденовирусного поражения роговицы было проведено динамическое изучение локального иммунологического статуса путем изучения экспрессии генов цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба и определения содержания самих цитокинов в надосадочной жидкости. Исследование проводили на базе ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Минздрава России, подразделение Институт вирусологии имени Д.И.Ивановского, г. Москва. Изучение локального цитокинового профиля проводили у 30 пациентов (30 глаз) до начала терапии. А также исследование было проведено у пациентов в группах терапии: Группа I – монотерапия кортикостероидами – 32 человека (32 глаза); Группа III – комбинация кортикостероидов и ЦсА – 33 человека (33 глаза)). При этом при наличии бинокулярного поражения роговицы выбирался глаз с более выраженными изменениями, приводящими к значительному изменению функций. В группах лечения исследование проводили на сроках 1 и 4 месяца от начала терапии. Подробное описание групп терапии представлено в пункте 2.5.

    Кроме того, для корректной интерпретации результатов исследование было проведено у группы здоровых добровольцев – 30 человек (30 глаз) (см. черный сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Качественный анализ, то есть наличие или отсутствие экспрессии генов 16 цитокинов (ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α), проводили с помощью методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) путем определения их матричной РНК (мРНК).

    Субстратом для анализа служил свежий материал из клеточной культуры соскоба с конъюнктивы. Выделение тотальной РНК проводили по методике, предложенной P . Chomczynski, N. Sacchi в 1987 г. [37], согласно которой использовали метод кислой гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ экстракции. Лизат переносили в чистую пробирку и добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамилового спирта (25:24:1). Полученную смесь интенсивно встряхивали (10 секунд) и центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 15 минут. Затем брали надосадочную жидкость, добавляли равный объем изопропанола и оставляли при –20 °С на 6-8 часов, после чего центрифугировали спиртовую смесь при 12 тыс. об/мин в течение 15 минут для осаждения тотальной РНК и удаляли супернатант. Полученную РНК промывали охлажденным 75%-м этанолом, подсушивали при комнатной температуре в течение 5-6 минут и растворяли в 40 мкл стерильной воды.

    Определение количества выделенной РНК производили фотометрическим методом. На спектрофотометре измеряли поглощение раствора РНК при длине волны 260 нм. О степени очистки препаратов тотальной РНК от примесей белка или фенола судили, сопоставляя величины оптической плотности, полученные при 260 нм и 280 нм. Обратная транскрипция и ПЦР -амплификация были выполнены в соответствии с методикой, предложенной Gelder. После проведения обратной транскрипции помещали полученную к опию ДНК (кДНК) на хранение в морозильник при – 20 °С. ПЦР проводили в объеме 25 мкл на программируемом амплификаторе МС 2 (АО «ДНК-технология», г. Москва). После 26 циклов полимеразной цепной реакции для получения полноразмерных ПЦР-продуктов вели достройку синтезированной ДНК в течение 7 минут при 72°С. После амплификации продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2,5% агарозном геле. В качестве позитивного контроля амплификации использовали β-actin. Электрофорез кДНК проводили в 2,5% агарозном геле с бромистым этидием (0,5мкг/мл) в Трис-ацетатном буфере, содержащем 0,2 М ЭДТА. Электрофорез вели в течение 35 минут в камерах для горизонтального электрофореза фирмы BioRad Laboratories, Inc. Фотографировали на пленку Микрат-500 под мягким (360нм) ультрафиолетовым освещением. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза (G 1758) фирмы Promega, США.

    Количественную оценку проводили для 6 цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-α), которые были определены для исследования после первого этапа диагностики. Содержание цитокинов определяли в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результат фиксировали в пкг/мл. Были использованы тест-системы «Вектор-БЕСТ» (Россия). Метод определения основан на техстадийном «сэндвич»-варианте твердофазного ИФА с использованием моноклональных антител к указанным цитокинам.

    На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами, с которыми связывается имеющийся в образцах цитокин, соответствующий конкретному набору. Для этого во все лунки вносили по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем – по 100 мкл калибровочных или исследуемых образцов в каждую лунку. Полученные смеси инкубировали при температуре 18-20 °С в течение 120 минут в термостатируемом шейкере с частотой 700 об/мин. Затем с помощью промывочного устройства промывали лунки планшета 5 раз, после чего в лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата № 1. Инкубировали при температуре 18-20 °С в течение 60 минут в шейкере с частотой 700 об/мин и повторяли пятикратную процедуру промывки. Затем вносили в лунки планшета рабочий раствор конъюгата № 2 в количестве 100 мкл и инкубировали в течение 30 минут в шейкере при температуре 18-20 °С с частотой 700 об/мин, после чего снова промывали лунки планшета.

    Следующим этапом производили добавление рабочего раствора тетраметилбензидина (100 мкл) во все лунки и выдерживали планшет в защищенном от света месте в течение 25 минут при температуре 18 -20 °С. После чего вносили стоп-реагент в лунки в количестве 100 мкл в той же последовательности, что и предыдущий рабочий раствор. Измерение оптической плотности производили с помощью спектрофотометра в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – 620 нм.

    По результатам измерения вычисляли среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с анализируемыми образцами и производили построение калибровочного графика, с помощью которого определяли искомое значения содержания цитокина в образце.


Страница источника: 48
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии»«Живая» хирургия в рамках XVI Всероссийской конференции с ме...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Секундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя VisuMax как способ лечения осложнений операции Lasik. ВидеопрезентацияСекундо В. Трансплантация рефрактивной лентикулы  используя ...

Симпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операцийСимпозиум компании «Алкон» с демонстрацией показательных операций

Осложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапииОсложненная катаракта: особенности хирургии и фармакотерапии

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии XVI Всероссийская конференция с  международным участием Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Бактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмохирургаБактериальные инфекции глаза: взгляд офтальмолога и офтальмо...

Офтальмология: диагностика проблем, пути решенияОфтальмология: диагностика проблем, пути решения

Глаукома:теория и практика. Новый взглядГлаукома:теория и практика. Новый взгляд

Актуальные вопросы в лечении и профилактике ВМДАктуальные вопросы в лечении и профилактике ВМД

Современные аспекты и новые возможности ОКТСовременные аспекты и новые возможности ОКТ

Патология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности и новые перспективы в решении «старых» проблемПатология глазной поверхности и глаукома. Новые возможности ...

Новейшие достижения в офтальмологииНовейшие достижения в офтальмологии

X Съезд офтальмологов России X Съезд офтальмологов России

Иммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении воспалительных заболеваний глаз различной этиологииИммуномодулирующая и противовирусная терапия при лечении вос...

«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии«Нова Медика»: новые горизонты офтальмологии

Рейтинг@Mail.ru