Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Метод проточной цитофлуориметрии


1----------

     Произведено иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и определение митохондриальной активности лимфоцитов с использованием метода проточной цитофлуориметрии [62] на приборе CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США). Метод проточной цитофлуориметрии основан на регистрации сигналов флуоресценции по нескольким каналам (FL1-FL5), прямого (рассеяния под малыми углами от 1 до 100) и бокового светорассеяния (рассеяния под углом 900) от каждой отдельной клетки дисперсной среды. Дисперсная среда представлена клеточной суспензией, предварительно меченной флуоресцирующими моноклональными антителами, специфически связывающими определенные компоненты рецепторного аппарата лимфоцита. Гидродинамическая фокусировка позволяет создать ламинарный поток без перемешивания клеточной суспензии, что обеспечивает строго определенное положение каждой клетки в проточной ячейке относительно луча света. Высокая воспроизводимость и точность метода обеспечивается большой выборкой анализируемых объектов, высокой скоростью измерения, возможностью измерения параметров малых популяций лимфоцитов.

    Данный метод позволяет определить количество клеток в различных популяциях лимфоцитов и их энергетический метаболизм, основанный на определении активности СДГ. Преимуществами проточной цитофлуориметрии является возможность проведения одновременного иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови, определения митохондриальной активности основных и малых популяций лимфоцитов [57].

    В работе были исследованы следующие популяции лимфоцитов (Табл. 3).

    В исследовании использовались флуоресцирующие моноклональные анктитела производства Beckman Coulter и Beckton Dicinson (США): CD4-FITS, CD3-FITS, CD3-PerCP, CD3-PE-Cy5, HLA-DR-FITS, CD8-PE, CD19-PE, CD294-PE, CD127-PE, CD161-PE, CD(16-56)-PE, CD25PE-Cy7, CD45-PERCP, CD45PE-Cy5, CD45PE-Cy7. Для оценки популяционного состава лимфоцитов был использован стандартный протокол [88]. После инкубации цельной крови с моноклональными антителами, образцы лизировали и фенотипировали на автоматической станции пробоподготовки TQ-PREPTM (Beckman Coulter, США) с использованием набора реагентов ImmunoPrep Reagent System (Beckman Coultr, США) [58].

    Для определения активности СДГ был использован лимфоконцентрат венозной крови. Пробу крови разбавляли средой RPMI-1640, предварительно подогретой до 37°С, в соотношении 1:3, после чего разбавленную кровь наслаивали на градиент фиколл-Гипак плотностью 1,077 (Histopaque-1077 Sigma diagnostics №1077-1) в соотношении 4:1 в пробирку с коническим дном. Пробу центрифугировали 20 минут при 2000 об./мин. После этого путем центрифугирования клетки отмывали средой RPMI-1640, предварительно подогретой до 37°С (10 минут при 2000 об./мин.). Надосадочную жидкость отбирали, к осадку добавляли среду RPMI-1640, предварительно подогретую до 37°С до общего объема 1000 мкл. Полученную клеточную суспензию добавляли в маркированные пробирки, содержащие флуоресцирующие моноклональные антитела, в соответствии с разработанным протоколом, по 50 мкл в каждую. Пробирки выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 15-ти минут.

    Затем в маркированные пробирки добавляли по 50 мкл реагента Cytofix/Cytoperm (BD Cytofix/Cytoperm № 554722) для пермеабилизации клеток, выдерживали 15 минут, после чего клетки отмывали реагентом Cell Wash (BD Cell Wash № 349524) (5 минут при 2000 об./мин.). Далее в маркированные пробирки добавляли по 200 мкл реагента Perm/Wash (BD Pharmingem Perm/Wash Buffer № 554723), выдерживали 15 минут и отмывали реагентом Cell Wash (5 минут при 2000 об./мин.). После отмывки в каждую пробирку с клеточной суспензией пробы «стандарт» добавляли 400 мкл фиксирующего раствора CellFIX (BD CellFIX № 340181). Пробы «стандарт» исследовали на проточном цитофлуориметре. К клеткам пробы «цитохимия» добавляли по 1000 мкл раствора СДГ, клетки инкубировали 30 минут в водном термостате при температуре 370 С. После этого клетки отмывали реагентом Cell Wash в течение 5-ти минут при 2000 об/мин. В каждую пробирку добавляли по 400 мкл фиксирующего раствора CellFIX (BD CellFIX № 340181). Пробы «цитохимия» исследовали на проточном цитофлуориметре.

    Оценку количественных характеристик основных и малых популяций лимфоцитов проводили в соответствии с существующими рекомендациями [85].


Страница источника: 55

Роговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научн...

 ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества

Сателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Росс...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Эндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференцияЭндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенациональн...

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Рейтинг@Mail.ru