Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Экспериментальное исследование доставки рибофлавина в строму роговицы при различных технологиях УФ-кросслинкинга


1----------

     В экспериментальных исследованиях доктора G. Wallensak и соавторов (2004) было показано, что УФ излучение с длиной волны 370 нм, используемое при проведении УФ-кросслинкинга, обладает повреждающим эффектом на клетки роговицы [182]. Так, во время исследований на кроликах, после УФ-кросслинкинга авторы обнаружили гибель кератоцитов на глубине до 350 мкм, а через 6 месяцев их популяция полностью восстанавливалась. Временная потеря кератоцитов происходит так же после ФРК и LASIK и не считается критической. В отличие от кератоцитов, клетки эндотелия роговицы имеют низкую регенеративную способность [168] и их повреждение во время проведения операции является недопустимым. В серии экспериментов на глазах животных E. Spoerl (2003) определил, что строма роговицы, пропитанная рибофлавином, поглощает 95% УФ излучения, в то время как в отсутствии рибофлавина данный показатель составляет лишь 32%. Так был продемонстрирован защитный эффект, которым обладает рибофлавин по отношению к эндотелию роговицы и подлежащим структурам глазного яблока [183].

    Таким образом, полное пропитывание стромы роговицы рибофлавином является необходимым условием успешного и безопасного проведения УФ–кросслинкинга. В связи с этим, изучение возможности проникновения рибофлавина в строму роговицы при моделировании различных технологий УФ-кросслинкинга явилось важным этапом нашего исследования.

    Исходя из этого, задачей явилась разработка высокоточного и достоверного способа обнаружения рибофлавина в строме роговицы и применение его для оценки эффективности различных технологий УФ-кросслинкинга.

    Для выявления проникновения рибофлавина в строму роговицы в ходе исследования применяли ИК Фурье-спектроскопию, являющуюся одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования структуры химических веществ, который может использоваться для обнаружения их в биологических жидкостях и тканях.

    ИК-спектры отражения являются специфичными для каждого химического вещества благодаря тому, что отражают наличие каждой функциональной группы в их составе и характер химических связей, присутствующих в молекуле. Полученный с помощью ИК Фурье–спектроскопии ИК-спектр отражения рибофлавина, как и других химических веществ, является уникальным и позволяет четко идентифицировать его присутствие в роговице.

    <b >Ход эксперимента по изучению проникновения рибофлавина в роговицу при различных технологиях УФ-кросслинкинга</b >

    Данное исследование было выполнено совместно с к.м.н. Измайловой С.Б. на базе Института нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН и Центра Фундаментальных и Прикладных Медико-биологических Проблем МНТК «Микрохирургия глаза».

    Исследование проводили на 9-и кадаверных глазах от 8-и доноров трупов без признаков патологии роговицы, не соответствующих критериям отбора для кератопластики. Возраст доноров составил от 30 до 39 лет. Интервал от момента смерти до энуклеации составил не более 8-и часов, от момента смерти до проведения эксперимента проходило не более 11 часов.

    Были выделены 3 группы по 3 глаза.

    В первой группе перед закапыванием на роговицу раствора рибофлавина эпителий предварительно удаляли, что соответствовало начальному этапу выполнения УФ-кросслинкинга по классической технологии.

    Во второй группе эпителий не удаляли, а для увеличения его проницаемости на него в течение 30-и минут инстиллировали 0,5% раствор проксиметакаина, содержащий бензаклония хлорид (Алкаин 0,5%), таким образом моделировали этап технологии трансэпителиального УФ-кросслинкинга.

    В третьей группе для увеличения проницаемости эпителия выполняли механическое нарушение его целостности с помощью инструмента для дозированной скарификация эпителия роговицы.

    В ходе эксперимента кадаверный глаз помещали в держатель, после чего согласно изучаемой технологии УФ-кросслинкинга, эпителий роговицы удаляли или обрабатывали для усиления проницаемости. После этого, для определения спектра контроля, роговицу выделяли и помещали на предметный столик ИК-микроскопа эндотелием вверх. Во всех случаях спектры регистрировали в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) на ИК-микроскопе Hyperion 2000 с кристаллом германия (Ge), совмещенным с вакуумным ИК-Фурье спектрометром модели IFS 66v/s (Bruker). Спектры усредняли по 50 сканам.

    На ИК - микроскопе в режиме НПВО регистрировали ИК-спектр отражения рибофлавина в виде порошка.

    Сравнивали ИК-спектр отражения рибофлавина с контрольным ИК-спектром отражения роговицы. В результате сравнения, выявили полосы спектра, не совпадающие по положению и интенсивности. Именно эти полосы служили индикатором присутствия рибофлавина в роговице.

    Далее 0,1 % раствор рибофлавина в физиологическом растворе капельно наносили на переднюю поверхность кадаверной роговицы в течение 30 мин, после чего смывали физиологическим раствором до прозрачных смывных вод. Затем роговицу помещали на предметный столик ИК-микроскопа, и с помощью ИК-НПВО объектива регистрировали несколько ИК-спектров отражения с разных участков ее эндотелиальной стороны для выявления возможных флуктуаций.

    После этого проводили сравнение полученных ИК-спектров отражения, при этом о проникновении рибофлавина в роговицу свидетельствовало увеличение интенсивности полос ее ИК-спектра, характерных для рибофлавина.

    Для сравнительного анализа была выбрана самая интенсивная полоса в спектре рибофлавина - 1542 см-1, которая относится к сопряженным связям С=С и С=N в конденсированных ароматических кольцах рибофлавина, и менее всего подвержена влиянию взаимодействия с растворителем, что приводит к сохранению интенсивности этой полосы в спектре раствора. Количественной характеристикой изменения ИК-спектров служило изменение относительной интенсивности полос 1542 см-1 и 1640 см-1, выраженное в процентах. Полоса 1640 см-1 была выбрана для сравнения в виду того, что она относится к той же пептидной связи что и полоса 1542 см-1 и отражает в ней исключительно различный тип колебаний, следовательно, в одинаковых условиях их относительная интенсивность остается постоянной.

     Полученные данные в дальнейшем использовали для обоснования эффективности УФ-кросслинкинга в различных его модификациях.

    Построение графиков регистрируемых спектров отражения производили с помощью программы Origin Pro 8.0.

    <b >Результаты эксперимента по изучению проникновения рибофлавина в роговицу при различных технологиях УФ-кросслинкинга</b >

    При анализе усредненного инфракрасного спектра отражения роговиц I-й группы выявили достоверное увеличение относительной интенсивности полосы 1542 см-1 по сравнению с контролем на 7,3% ± 0,5% (Рис. 6, таблица 1), что свидетельствовало о проникновении рибофлавина в строму роговицы.

    Анализ усредненного спектра роговиц III-й группы показал схожие результаты, относительная интенсивность его полосы 1542 см-1 оказалась достоверно выше на 7,8% ± 0,6% по сравнению с контролем (Рис. 7, таблица 1).

    Относительная интенсивность полосы 1542 см-1 усредненного ИК-спектра роговиц в условиях интактного эпителия (II-я группа) не имела статистически значимой разницы по сравнению с контролем (Рис. 8, таблица 1).

    В сводной таблице 1 представлены данные отношения интенсивности полосы 1542 см-1 к полосе 1640 см-1 в группах исследования и их изменение по отношению к контролю.

    Таким образом, нами определено, что метод ИК Фурье–спектроскопии с регистрацией ИК-спектров отражения может быть успешно использован для изучения возможности проникновения рибофлавина в строму роговицы. Результаты исследования показали пропитывание всех слоев роговицы рибофлавином после ее субтотальной деэпителизации. Отсутствие статистически значимого изменения относительной интенсивности полосы 1542 см-1 ИК-спектра роговиц, на которые был инстиллирован 0,5% раствор проксиметакаина, содержащий бензаклония хлорид, по сравнению с контролем, свидетельствует об отсутствии проникновения рибофлавина через эпителий роговицы, обработанной данным способом, что ставит под сомнение достаточную эффективность трансэпителиального УФ-кросслинкинга и обосновывает нецелесообразность применения его в клинике.

    Нами впервые было показано, что после обработки эпителия роговицы скарификатором новой модели происходит полное пропитывание роговицы рибофлавином, что обосновывает эффективность технологии УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы.


Страница источника: 48
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru