Online трансляция


Научно-практическая конференция с международным участием
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Москва. Гостиница Holiday Inn Sokolniki
4 февраля 2017 г.



15-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Сочи, 16-17 марта 2017
Официальный сайт

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 22 2016
№ 21 2016
№ 20 2015
№ 19 2015
№ 18 2015
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
№ 2 (28) Апрель 2016
№ 1 (27) Март 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:УДК 617.735-073.5

Локальное субретинальное введение ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами, в эксперименте


1Калужский филиал «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии»
2Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифософского
3МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
4Институт биологии гена Российской академии наук

     Методы клеточной трансплантации в настоящее время открывают широкие возможности возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах и тканях. Стволовые клетки также способствуют активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации [4, 9].

    В экспериментальной офтальмологии, в работах по трансплантации эмбриональных частей сетчатки в сетчатку взрослого млекопитающего было показано, что имплантированная ткань интегрируется с сетчаткой реципиента, и даже могут устанавливаться морфологические контакты с первичными зрительными центрами [8]. Также проводились исследования возможности встраивания стволовых клеток в слои сетчатки и дифференцировки их в фоторецепторы [17, 18]. Было показано, что стволовые клетки, введенные интравитреально, если не погибают в течение нескольких суток после трансплантации, то мигрируют, встраиваются в слои сетчатки и формируют многочисленные отростки, идентичные нормальным аксонам, а в отдельных случаях аксоны введенных клеток прорастают в зрительный нерв и остаются жизнеспособными сроком до 30 дней [10, 20].

    Применение стволовых клеток из мезенхимальной ткани является перспективным за счет возможности получения материала от самого реципиента. В ряде работ было показано, что мезенхимальные стволовые клетки эффективны в лечении повреждений роговицы [12, 14, 16], способствуют повышению выживаемости ганглиозных клеток при глаукоме [11]. Отмечается способность стволовых клеток ингибировать апоптоз клеток сетчатки, уменьшать воспаление, вызванное лазерным воздействием, и ограничивать зону распространения лазерного повреждения [13].

    В исследованиях по влиянию стволовых клеток на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений в сетчатке у крыс линии Campbell [6] при токсическом поражении зрительного нерва [3], при лечении частичной атрофии зрительного нерва [5] было показано, что стволовые клетки оказывают выраженное стабилизирующее влияние на процессы дегенерации и на органические изменения: происходило краткосрочное улучшение функций сетчатки, подтвержденное методами ЭРГ. Однако все авторы указывают на кратковременность эффекта в связи с трудностями фиксации клеток в месте введения и их миграцией в другие отделы глаза.

    Предложены различные способы введения стволовых клеток при патологии сетчатки и зрительного нерва: внутривенное, субконъюнктивальное, субтеноновое, парабульбарное, интравитреальное, супрахориоидальное, введение в канал, образованный после радиальной оптической нейротомии. Преимущественным является метод субретинального введения в связи с возможностью максимального приближения к месту повреждения. Но, к сожалению, субретинальный способ введения клеток является достаточно травматичным и также не исключает миграции клеток.

    В настоящее время популярным направлением становится использование магнитных технологий с целью фиксации стволовых клеток в месте их введения. Впервые с этой целью стволовые клетки с магнитными наночастицами были использованы для доставки стволовых клеток к области печени. Для этого крысам в области печени размещали внешний магнит, который «притягивал» введенные внутривенно клетки, где они в итоге и депонировались [7, 19]. Также стволовые клетки с введенными в них магнитными наночастицами применяли для доставки к месту повреждения сосудов и сердца [15].

    По данным литературы в офтальмологии была проведена успешная попытка направленной доставки мезенхимальных стволовых клеток, меченных суперпарамагнитными частицами в область сетчатки, но целью исследования не явилась фиксация трансплантированного материала в зоне введения [21].

    Цель

    Разработать методику локального субретинального введения ксеногенных стволовых клеток, меченных магнитными частицами, и экспериментально обосновать ее эффективность.

    Материал и методы

    В работе использовалась линия стволовых клеток НЕК-293 GFP (human embryonic kidneys), полученная из клеток почки эмбриона человека, выращенная в культуре ткани, и трансфецированная GFP плазмидой.

    Для культивирования НЕК-293 применялась среда DMEM (ПанЭко, Россия) при добавлении 10% фетальной сыворотки крови (Perbio HyClone, США), L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 4% гентамицина (ПанЭко, Россия). Культура клеток инкубировалась при 370 С в СО2-инкубаторе. Клетки росли на площади 25 см2 во флаконах («Costar»). По мере нарастания культуры клеток почек эмбриона человека НЕК-293 до концентрации 1,5 × 105 клеток мл − 1 клетки подвергались трансфекции полученными конструкциями: EGFP-N1 («Clontech»). Трансфекция осуществлялась с помощью реагента ExGene 500 (Fermentas, R0511) согласно протоколу. Селекция клонов, несущих встроенную конструкцию, проводилась с помощью реагента гиницитина (G418, Invitrogen # 15750045) в течение десяти дней. После селекции с использованием антибиотика клоны, устойчивые к G418, были использованы для анализа с помощью микроскопа (Olympus). Все колонии были GFP позитивными. Клетки были рассеяны на чашки Петри («Corning») в количестве около 300 тыс. Через 24 часа были добавлены магнитные частицы («Invitrogen»; H54700) в соотношении 1:100. Магнитные частицы были предварительно обработаны поверхностно активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки. Комбинация клеток НЕК/GFP с магнитными частицами культивировалась 24 часа при температуре 370 С в СО2-инкубаторе. Через 24 часа трансгенная культура по гену GFP с магнитными частицами была пятикратно промыта раствором Хенкса (ПанЭко, Россия) и обработана раствором трипсина (ПанЭко, Россия). Коллекцию клеток осуществляли в 1,5 мл эппендорф-пробирке фирмы Corning. Клетки были осаждены на центрифуге фирмы Eppendorf в течение 3 минут при 2,5 тыс. оборотов в минуту. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре НЕК-293 добавляли суспензию магнитных частиц. Клетки инкубировали с частицами 24 ч в СО2-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняли и клетки 5-кратно отмывали от свободных магнитных частиц раствором Хенкса. Производилась оценка влияния магнитных частиц на пролиферативную активность стволовых клеток костного мозга методом МТТ теста, на функциональную активность стволовых клеток костного мозга и жизнеспособность с использованием флюоресцентных красителей.

    Исследование in vivo проведено на 84 глазах 42 кроликов породы шиншилла в возрасте 6 мес. весом от 2,5 до 3,5 кг. Все правые глаза были опытными (42 глаза), а левые (42 глаза) – контрольными. Всем кроликам в оба глаза за 30 минут до операции в конъюнктивальную полость инстиллировали 1-2 капли 1% раствора атропина и 10% мезатона для достижения медикаментозного мидриаза. Всем кроликам в качестве анестезии выполняли общий наркоз, который осуществляли внутримышечным введением 1% раствора гексенала из расчета 0,5 мл на 1 кг веса животного. Общее обезболивание дополняли трехкратной инстилляцией в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина. Перед операцией всем кроликам проводили промывание конъюнктивальной полости раствором фурацилина 1:5000. Иммобилизация животных производилась путем тугого бинтования.

     В опытной группе (42 глаза) после установки блефаростата, отступя 3 мм от лимба, с помощью конъюнктивальных ножниц в нижнем сегменте производился разрез конъюнктивы и теноновой оболочки протяженностью 10 мм. Далее выделяли нижнюю прямую мышцу, брали ее на шов-держалку. Затем в 7-ми мм от лимба подшивали комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, с многополюсным реверсивным намагничиванием с напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом. В 3-х мм от лимба в верхнем и верхне-наружном сегменте устанавливали три порта 25G в проекции плоской части цилиарного тела, фиксировали инфузионную систему, световод, витреотом, производили срединную витрэктомию. Суспензию объемом 0,02 мл, содержащую стволовые клетки (n~6000), меченные магнитными частицами, вводили субретинально при помощи разработанного устройства для дозирования с иглой 25G, на конце которой расположена изогнутая канюля 41G с заточенным нижнем краем. Для предотвращения выхождения клеток через ретинотомическое отверстие сразу после их введения витреальную полость заполняли газо-воздушной смесью. По завершению эксперимента лазерный зонд обрезался на уровне полимерного эластичного магнитного имплантата. На склеротомические отверстия и конъюнктиву накладывался шов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon).

    В группе контроля (42 глаза) хирургическое введение стволовых клеток субретинально производили без фиксации полимерного эластичного магнитного имплантата с лазерным зондом.

    Всем экспериментальным животным в послеоперационном периоде через 3 часа, 1, 3, 5, 7, 10, 14 суток, 1 мес. проводили биомикроскопию, офтальмоскопию глазного дна с фотографированием, ультразвуковое офтальмосканирование, оптическую когерентную томографию (ОКТ), компьютерную томографию (КТ), морфологическое исследование (криогистологические срезы) в режиме флюоресценции, оптимальном для зеленого флюоресцентного белка.

    Результаты

    По результатам эксперимента in vitro было показано, что проникновение магнитных частиц внутрь стволовых клеток незначительно снижает пролиферативную активность (до 5% через 72 часа инкубации). Это говорит о том, что жизнеспособность клеток при данной технологии составляет до 95%.

    При добавлении к культуре клеток акридинового желтого красителя соотношение зеленой (ДНК) и красной (РНК) люминесценции было увеличено, что говорит о функциональной активности стволовых клеток, содержащих магнитные частицы.

    Также при добавлении акридинового желтого красителя и эпидия бромида к культуре стволовых клеток, содержащих магнитные частицы, соотношение живых клеток к некротическим показало жизнеспособность клеток до 95%.

    По результатам клинических исследований при биомикроскопии в сроки наблюдения 1-3 суток в обеих группах отмечалась инъекция глазного яблока в зоне проведения хирургического вмешательства, которая проходила к 5-м суткам. На всех сроках наблюдения швы конъюнктивы и склеротомических отверстий были адаптированы, оптические среды прозрачны, воспалительных явлений не наблюдалось.

    По результатам офтальмоскопии на 1-е сутки во всех глазах опытной и контрольной групп визуализировалась локальная отслойка сетчатки в зоне введения клеток, дефект сетчатки и сосудистой оболочки. К 3-м суткам отслойка сетчатки не визуализировалась, но дефект сетчатки и сосудистой оболочки сохранялся. В дальнейшие сроки наблюдения было сложно визуализировать место локального введения клеток.

    По данным ультразвукового исследования во всех глазах опытной и контрольной групп на 1-е сутки визуализировалась локальная отслойка сетчатки высотой 1,0-1,4 мм, которая к 3-м суткам уменьшилась до 0,4-0,7 мм, а к 5-м суткам не визуализировалась. Во все сроки наблюдения в обеих группах визуализировалась мелкодисперсная взвесь в стекловидном теле, а в опытной группе – эхо-тень от магнита.

    По данным КТ во всех случаях выявлено расположение ПЭМИ в правом ретробульбарном пространстве в нижне-латеральном квадранте, левые орбиты были интактны, патологических очагов выявлено не было.

    По данным флюоресцентной микроскопии криосрезов энуклеированных глазных яблок в 1-е сутки во всех 6-ти глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой, в стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были (рис. 1a-в). Во всех глазах группы контроля были обнаружены единичные клетки или группы клеток НЕК-293 GFP в полости стекловидного тела, не связанные с другими структурами глаза (рис. 2а, б).

     На 3-и сутки во всех глазах опытной группы клетки НЕК-293 GFP располагались также в месте введения под сетчаткой. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что клетки, находящиеся под сетчаткой, являются живыми (рис. 3a-в). В группе контроля в 3-х глазах из 6-ти в полости стекловидного тела были обнаружены скопления клеток НЕК-293 GFP, не связанные с другими структурами глаза, в остальных 3-х глазах клетки HEK-293 GFP обнаружены не были (рис. 4а, б).

    В сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток в опытной группе клетки HEK-293 GFP также располагались в месте их введения, но количество клеток снижалось на каждом последующем сроке наблюдения (рис. 5а-в). К сроку 1 мес. клетки обнаружить не удалось ни в одном случае, но во всех 6-ти глазах наблюдалась присклеральная флюоресценция в зоне подшивания ПЭМИ (рис. 6). В группе контроля в сроки наблюдения 5, 7, 10, 14 суток и 1 мес. клетки не визуализировались.

    Обсуждение

    В предыдущих работах нами была доказана безопасность и эффективность разработанной технологии культивирования мезенхимальных стволовых клеток с магнитными частицами [1, 2]. В данном исследовании мы использовали клеточную линию HEK-293 в связи с доступностью материала, легкостью культивирования и возможностью провести трансфекцию GFP-плазмидой, что давало неоспоримое преимущество при проведении флюоресцентной микроскопии криогистологических срезов в эксперименте in vivo. По результатам нашего исследования безопасности и эффективности культивирования данного типа клеток с магнитными микрочастицами было выявлено, что жизнеспособность составляет 95%, это значительно превышает результаты, полученные другими авторами, использующими магнитные наночастицы, где жизнеспособность достигала лишь 30% к первым суткам [15].

    По проведенным клиническим исследованиям нами было показано, что предложенная хирургическая методика локального субретинального введения клеточного материала является контролируемой и малоинвазивной, риск травматизации тканей минимален в связи с возможностью визуализации места расположения ПЭМИ за счет диафаноскопии и разработанного устройства дозирования, осуществляющего деликатный доступ в субретинальное пространство.

    В 2012 г. Yanai А. с соавт. доказали возможность использования магнитных наночастиц для направленной доставки стволовых клеток в область сетчатки, но авторы не ставили перед собой цель длительной фиксации трансплантированного материала в зоне введения [21]. Проведенное нами морфологическое исследование выявило, что предложенная методика позволяет осуществить фиксацию клеточного материала в месте их локального введения сроком до 14 дней. Отсутствие клеток в зоне введения через 1 мес. мы связываем с иммунным ответом на ксеногенные стволовые клетки.

    Заключение

    Разработанная технология введения магнитных частиц в цитоплазму эмбриональных стволовых клеток почки человека линии НЕК-293 позволяет получить функционально активную и жизнеспособную клеточную популяцию, пригодную для экспериментальной трансплантации. Разработанное устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток обеспечивает деликатное введение клеток с минимальной травматизацией окружающих тканей. ПЭМИ с лазерным зондом оригинальной конструкции позволяет проводить интраоперационную диафаноскопию с целью точного определения места фиксации и последующего контролируемого локального введения стволовых клеток. Модифицированный нами хирургический способ субретинального введения стволовых клеток с проведением срединной витрэктомии и заполнением витреальной полости газовоздушной смесью позволяет избежать выхода клеток из субретинального пространства в полость стекловидного тела.

    Предложенная оригинальная методика локального субретинального введения стволовых клеток, меченных магнитными частицами, с эписклеральной фиксацией полимерного эластичного магнитного имплантата является эффективным способом фиксации клеточного материала в зоне трансплантации. Данная технология может стать основой для изучения механизмов воздействия стволовых клеток на очаг повреждения, разработки новых перспективных стратегий в офтальмологии, а также открыть новые возможности применения стволовых клеток в качестве средств нейропротекции или альтернативных терапевтических приемов при лечении различной патологии.

    

    Поступила 26.08.2014

    

    Сведения об авторах:

    Белый Юрий Александрович, докт. мед. наук, профессор, зам. директора по научной работе;

    Терещенко Александр Владимирович, докт. мед. наук, директор Калужского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

    Калужский филиал ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

    Темнов Андрей Александрович, докт. мед. наук, зав. лабораторией клеточных и физико-химических медицинских технологий

    ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы»

    Семенов Александр Дмитриевич, докт. мед. наук, профессор, гл. научн. консультант;

    Миргородская Светлана Александровна, аспирант

    ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России

    Адрес: 127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59а

    E-mail: info@mntk.ru

    Ревищин Александр Владимирович, канд. биол. наук, ст. научн. сотрудник группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий;

    Павлова Галина Валерьевна, докт. биологических наук, профессор, руководитель группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий;

    Куст Надежда Николаевна, ст. лаборант-исследователь группы нейрогенетики и генетики развития отдела геномики и клеточных технологий

    ФГБУН «Институт биологии гена РАН»


Страница источника: 65
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru