Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Заключение и обсуждение


1----------

    В настоящее время показано, что возникновение реакции тканевой несовместимости с развитием болезни трансплантата роговицы и исходом в стойкое помутнение, является наиболее частой причиной неудовлетворительных результатов кератопластики. При этом, помутнение в посттрансплантационном периоде развивается от 5 до 70% наблюдений в зависимости от исходной этиологии бельма [29, 26, 30, 5, 8, 93, 118].

    Ряд авторов отдельно выделяют группу пациентов с высоким риском развития реакции отторжения сквозного трансплантата роговицы, в которую включают реципиентов с тяжелыми бельмами ожоговой этиологии, васкуляризированными бельмами инфекционно-воспалительного генеза, помутнением трансплантата роговицы и реконструктивными операциями глаза на базе сквозной кератопластики [106, 72, 116, 189, 172, 109, 136, 95].

    «Золотым стандартом» защиты аллогенных трансплантатов от отторжения служит иммуносупрессивная фармакотерапия. Однако для профилактики помутнения трансплантата роговицы локальное применение препаратов этой группы ограничено отсутствием или дефицитом «глазных лекарственных форм», их недостаточным терапевтическим действием, а при системном и длительном применении – возникновением ряда побочных эффектов: гепато- и нефропатий, вторичного иммунодефицита и активации латентных вирусных инфекций [21, 186, 172, 214]. Кроме того, до 46% реципиентов с пересадкой роговицы остаются резистентными к иммуносупрессивной фармакотерапии [5].

    В последние годы наметился интерес трансплантологов к так называемой «малой иммуносупрессивной фармакотерапии» [13, 105] и использованию клеточных трансплантатов с иммунокорригирующими свойствами [45].

    Изучение свойств стволовых/прогениторных клеток костного мозга и прежде всего мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) позволило установить, что человеческие ММСК способны индуцировать иммунную толерантность при аллотрансплантации органов и тканей. Индукция иммунной толерантности происходит за счет блокировки активности эффекторных Т-клеток при аллогенной пересадке [153], активации размножения Т-регуляторных клеток с супрессивными свойствами, стимуляции секреции противовоспалительных цитокинов [50] и одновременной активации регенераторных процессов в поврежденных органах [45].

    Особую роль в формировании иммунной толерантности в организме играют неклассические молекулы HLA класса I МНС [187, 130]. Так, экспрессия HLA-G позволяет клеткам избежать иммунного надзора, то есть создает условия толерантности [148, 182, 130]. Проводятся исследования экспрессии молекул HLA-G при аллогенной трансплантации органов и тканей: почки [133], легкого [69], кожи [70], а также при других патологических состояниях [107].

    Не так давно было выявлено присутствие ММСК в глубоких слоях лимба [91, 173, 147, 150], обеспечивающих процессы физиологической и репаративной регенерации роговицы [91, 90, 77, 64], а также обнаружена экспрессия молекул HLA-G в роговице, как в норме, так и при некоторых патологических состояниях [144, 115].

    В настоящее время основным показанием к трансплантации лимбальных стволовых клеток является синдром лимбальной недостаточности, при этом используют: аутотрансплантаты лимба или лимбальные клетки с парного глаза, культивированные на различных носителях [139, 108], а также трансплантаты аллогенного лимба от доноров-трупов [93, 221, 131].

    Однако указанные методы трансплантации стволовых клеток лимба не позволяют обеспечить их широкое применение в клинической практике из-за опасности развития ятрогенного СЛН на парном глазу, технической сложности выполнения операции и необходимости длительной иммуносупрессивной терапии [186].

    Между тем известно, что консервация донорских роговиц в жидких средах, позволяет не только сохранить исходный фенотип клеток трансплантата, но и значительно снизить его иммунную реактивность за счет элиминации антигенпрезентирующих клеток Лангерганса [29, 8, 120, 56]. Однако в имеющейся литературе отсутствуют сведения о влиянии органотипической консервации на состояние ММСК лимба, назначение которых обеспечивать состояние толерантности окружающих тканей к трансплантату роговицы и регулировать процессы физиологической регенерации.

    Отсутствие в литературе сведений о применении аллогенных фрагментов лимба, содержащих ММСК, в качестве иммуносупрессивной клеточной терапии, с целью профилактики развития реакции отторжения донорских роговиц при кератопластике высокого риска, послужило выбором цели данного исследования.

    Работа включала два основных этапа исследований: экспериментальные (доклинические) и клинические.

    На доклиническом этапе работы – была выполнена разработка технологий микрохирургического выделения, органотипической и криогенной консервации аллогенных фрагментов лимба (АФЛ), критерием пригодности которых для последующего клинического применения являлось сохранение в АФЛ активированных ММСК, способных обеспечить приживление и индукцию восстановительной регенерации трансплантатов роговиц при сочетанной кератопластике высокого риска.

    На втором, клиническом этапе – впервые была проведена оценка эффективности сочетанной трансплантации донорских роговиц и аллогенных фрагментов лимба, прошедших предварительную предоперационную подготовку по разработанной технологии, обеспечивающей сохранность в них ММСК с иммуносупрессивными и толерогенными свойствами, для профилактики развития реакции отторжения трансплантата роговицы у реципиентов с кератопластикой высокого риска. Кроме того, по результатам динамического изучения концентрации основных цитокинов и молекулы толерогенности HLA-G в слезной жидкости, впервые предложена методика мониторинга локальной иммуносупрессии у реципиентов после сквозной кератопластики высокого риска, которая позволяет прогнозировать развитие кризов отторжения трансплантатов донорских роговиц.

    На доклиническом этапе были использованы фрагменты лимба n=192, полученные по разработанной микрохирургической технике из глазных яблок доноров-трупов с учетом топографо-анатомических особенностей расположения ММСК в разных зонах лимба. В отличие от ранее предложенных способов хирургического выкраивания фрагментов лимба, проводимых после выкраивания трансплантата роговицы или трепанации корнеосклерального диска, что в некоторых случаях требует использования специальных приспособлений [42] и значительно удлиняет сроки постмортального периода до забора фрагментов лимба [221, 131, 186], разработанная техника позволяет получить 5-6 фрагментов лимба, соответственно 10-12 АФЛ от одного донора в сроки не более 20±2,0 часов после смерти, при этом не происходит перфорации глазного яблока, что позволяет в дальнейшем выкраивать корнеосклеральный диск для СКП на одном глазу донора-трупа. Значительное уменьшение сроков постмортального периода позволяет максимально сохранить клетки лимба в жизнеспособном и функциональном состоянии. Это было подтверждено методом иммуногистохимической окраски препаратов АФЛ с использованием маркеров CD90, CD105, CD29, CD44, CD45 и HLA-G к ММСК лимба.

    Впервые была предложена технология предоперационной подготовки АФЛ для активации пролиферативных, иммуносупрессивных и толерогенных свойств ММСК, заключающаяся в первичной органотипической консервации. Анализ литературы позволил определить, что консервация, как гипотермическая, так и органотипическая способствует снижению иммуногенности органов и тканей, кроме того к 14 суткам консервации происходит естественная элиминация антигенпрезентирующих клеток (АПК) и лимфоцитов-пассажиров из ткани трансплантата [29, 120, 56]. Кроме того, органотипическая консервация, являющаяся эквивалентом культивирования клеток, способствует не только сохранению жизнеспособности клеток фрагмента лимба, но и увеличению клеточной массы, а также повышению их функциональной активности. При разработке технологии были сравнены результаты консервации в среде Борзенка-Мороз (I группа), стандартной, используемой для культивирования ММСК (II группа) и среде, обогащенной ростовыми и стимулирующими факторами (III группа) в течение 35-и суток. С помощью рутинного метода подсчета клеток в препаратах АФЛ было обнаружено отсутствие достоверных различий в объеме пролиферации клеток АФЛ в I-й и II-й группах исследования, при этом в препаратах III-й группы к 35-м суткам консервации происходила полная элиминация клеток из структуры АФЛ. Таким образом, была показана нецелесообразность использования сред обогащенных ростовыми и стимулирующими факторами.

    Результаты иммуногистохимической окраски препаратов АФЛ демонстрировали позитивную реакцию с маркерами ММСК: СD105, CD90, CD29 и CD44, что свидетельствовало о сохранности ММСК и их тканевых ниш в структуре фрагмента лимба на 28-е сутки органотипической консервации. Этот факт был подтвержден методом иммуноцитофлуориметрии с использованием панели антител к мультипотентным мезенхимальным стволовым клеткам (ММСК) на 28 сутки первичной органотипической консервации, более 98% исследуемых клеток АФЛ, мигрирующих из ткани и образовавших монослой, обладают иммунофенотипом ММСК и около 90% экспрессируют молекулу HLA-G.

    Оценку функционального состояния клеток АФЛ в процессе первичной органотипической консервации в течение 35-и суток проводили на основании динамического изменения содержания про- (IL-6, IFNγ, TNFα) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGFβ, IL-4) а также растворенной молекулы HLA-G5 в инкубационной среде. Было установлено, что при консервации АФЛ в средах I-й и II-й групп с 14-х суток происходит повышение содержания противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGFβ), а также HLA-G5, и снижение провоспалительных (IFNγ, TNFα), колебания содержания IL-6 и IL-4 носили незначительный характер.

    Установлено, что активация HLA-G-рецепторов на поверхности лимбальных клеток более существенно начинает проявляться с 14 суток органотипической консервации и сохраняется до предельно-оптимального срока консервации, равного 28-ми суткам.

    Таким образом, органотипическая консервация в среде Борзенка-Мороз и стандартной, используемой для культивирования ММСК, не только сохраняет клетки в жизнеспособном и пролиферирующем состоянии, но и способствует индукции иммуносупрессивных и толерогенных свойств лимбальных трансплантатов. При этом оптимальными сроками консервации следует считать 21-28-е сутки.

    Далее были проведены исследования возможности длительного хранения жизнеспособных АФЛ с иммуносупрессивными свойствами, для этого использовали АФЛ (n=64), прошедшие стадию первичной органотипической консервации по разработанной технологии в течение 28-ми суток. Были сформированы 2 группы АФЛ: АФЛ I-й группы замораживались в 60% среды Борзенка-Мороз, 30% сыворотки, 10% ДМСО; АФЛ во II-й группе (контроль) в 90% среды Борзенка-Мороз и 10% сыворотки.

    Сканирующая электронная микроскопия образцов АФЛ проводилась через 6 и 9 месяцев криоконсервации при t -80?С и через 12 и 24 месяца криоконсервации при t -196?С. Все образцы АФЛ, криоконсервированные в обоих режимах в указанные сроки, в отличие от контрольных образцов, имели четко выраженную архитектонику коллагеновых волокон интерстициального матрикса и расположенных в нем структурно сохранных ММСК. В образцах АФЛ контрольной группы отмечалось расширение пространств между коллагеновыми волокнами, наличие зон деструкции коллагеновых фибрилл в интерстициальном матриксе, набухание с размытостью границ ММСК.

    В отличие от хорошей морфологической сохранности всех образцов АФЛ, функциональная сохранность ММСК определялась с помощью вторичной органотипической консервации АФЛ после дефростации.

    Аллогенные фрагменты лимба, консервированные при -80°С, размораживались поочередно через 1, 3, 6 и 9 месяцев, при -196°С – через 6, 12, 18 и 24 месяца, и подвергались последующей вторичной органотипической консервации (при t 37°C в атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности) в течение 21 суток с использованием стандартной среды, используемой для культивирования ММСК.

    С помощью фазово-контрастной микроскопии было отмечено постепенное восстановление пролиферации клеток после размораживания АФЛ, ранее криоконсервированных при -80°С в течение 6 месяцев и 24 месяцев при -196°С. С 7 суток органотипической консервации была отмечена активная пролиферация клеток размороженных лимбальных фрагментов, с формированием монослоя к 14 суткам. Отмечено, что при размораживании АФЛ через 9 месяцев хранения при -80°С, признаков клеточной пролиферации в течение 14 суток вторичной органотипической консервации не наблюдалось, что, по-видимому, связано с полным разрушением клеточной массы в АФЛ.

    Таким образом, было установлено, что криоконсервация аллогенных фрагментов лимба по разработанной технологии с использованием сред, содержащих 10% ДМСО и 30% фетальной сыворотки при -80°С не более 6 месяцев и -196°С в течение 2-х лет и более, позволяет сохранить жизнеспособность и пролиферативную активность клеток, а также ультраструктуру АФЛ. Это явилось основанием для создания криобанка аллогенных фрагментов лимба на базе Глазного тканевого банка Головной клиники.

    Функциональную сохранность клеток размороженных АФЛ оценивали по динамике изменения содержания про- (IL-6, IFNγ, TNFα) и противовоспалительных (IL-10, IL-1RA, TGFβ) цитокинов, а также HLA-G5 в аликвотах среды на 21-е сутки вторичной органотипической консервации. Данные цитокинограммы показали, что начиная с 3-х суток, содержание провоспалительных цитокинов практически не увеличивается, тогда как противовоспалительные цитокины, такие как, TGFβ и IL-1RA нарастают, что с одной стороны подтверждает жизнеспособность клеток лимба, а с другой - сохранность их иммуносупрессивных свойств.

    Результаты проведенного иммунофенотипирования с использованием панели антител к ММСК клеток АФЛ, образовавших монослой к 21 суткам инкубации, подтвердили, что 98% клеток сохранили иммунофенотип ММСК после размораживания.

    Таким образом, впервые было показано, что разработанная технология вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации позволяет не только индуцировать пролиферативные свойства клеток лимба, но и способствует их функциональной активности, сопровождающейся выработкой противовоспалительных цитокинов и молекул толерогенности HLA-G5.

    На этапе клинических исследований было отобрано 69 пациентов с помутнением трансплантата роговицы, поступивших в учреждение для повторной кератопластики. Из них в контрольную группу вошло 33 пациента; в опытную группу – 36. Группы достоверно не различались по полу, возрасту и причинам помутнения роговицы. В анамнезе у пациентов обеих групп было от 1 до 3-х сквозных кератопластик.

    Сквозная кератопластика выполнялась консервированными донорскими роговицами по принятой в учреждении технике. В группе исследования проводилась одномоментная пересадка 3-х аллогенных фрагментов лимба, прошедших предоперационную подготовку по разработанной технологии. Биологические результаты трансплантации оценивали через 1, 3, 6 и 12 мес.

    Выявлено, что степень послеоперационной воспалительной реакции в группах исследования была незначительной (I-II степени). Несмотря на более обширную интраоперационную рану, связанную с подсадкой АФЛ в опытной группе, воспалительная реакция не была более выраженной или чаще встречаемой. Значительных воспалительных реакций III–IV степени у пациентов обеих групп не отмечалось.

    Клинические результаты функциональной активности АФЛ, связанные с выраженностью иммуносупрессивных и толерогенных свойств ММСК, оценивались по динамике показателей концентрации провоспалительных (IL-6, IFNγ, TNFα), противовоспалительных (IL-10, IL-1RA, TGFβ) цитокинов и растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 в СЖ реципиентов опытной (СКП с одномоментной сотрансплантацией АФЛ, n=36) и контрольной (СКП без сотрансплантации АФЛ, n=33) групп.

    Достоверно установлено, что у пациентов обеих групп концентрации провоспалительных цитокинов в СЖ до СКП, через 1, 4 и до 7-х суток после операции были сопоставимо одинаковыми. Далее к 30-м суткам у пациентов опытной группы происходило дальнейшее снижение, а к 90 суткам – значительное, до уровня ниже исходного, понижение концентрации этих цитокинов, в то время как у пациентов контрольной группы, напротив, отмечалось постепенное нарастание концентрации провоспалительных цитокинов.

    Замеры концентраций противовоспалительных цитокинов в динамике продемонстрировали наличие выраженной функциональной активности ММСК АФЛ у пациентов опытной группы. Так уже с 4-х суток после СКП отмечалось повышение концентрации противовоспалительных цитокинов, а с 7-х суток увеличение содержания растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 в СЖ. Дальнейшее значительное нарастание концентрации противовоспалительных цитокинов прослеживалось до 30-х суток, далее наблюдался период стабилизации активности ММСК на уровне терапевтической концентрации. Нарастание концентрации растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 проходило умеренно до 90-х суток без тенденции к стабилизации ММСК по этому показателю.

    При этом, у пациентов контрольной группы концентрации противовоспалительных цитокинов в СЖ с 4-х суток после СКП значительно понижались и в течение всего периода изучения не повышались до исходного, предоперационного, уровня. Показатели концентрации растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 у пациентов этой группы не изменялись и отличались стабильностью в течение всего периода изучения.

    Таким образом, на основании клинических результатов функциональной активности АФЛ впервые показано наличие иммуносупрессивных и толерогенных свойств, связанных с функциональной сохранностью ММСК после сотрансплантации у пациентов с СКП высокого риска. По результатам динамического изучения концентрации основных цитокинов и растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 в СЖ предложена методика мониторинга локальной иммуносупрессии у реципиентов после СКП высокого риска, которая позволяет прогнозировать развитие кризов отторжения трансплантатов донорских роговиц.

    Анализ биологического результата сквозной кератопластики в группах исследования показал, что прозрачное состояние трансплантата в процессе динамического наблюдения в течение года сохранялось у 31 (86,1%) реципиента основной группы, тогда как в контрольной группе – только у 23 (69,7%).

    Результаты исследования потери эндотелиальных клеток (ЭК) в трансплантатах роговиц в течение 12 месяцев после операции показали, что , по мере увеличения сроков наблюдения после пересадки, потеря ЭК у пациентов в контрольной группе была выше и достигала 23,8% к концу срока наблюдения, что коррелирует с данными по потере ЭК трансплантатов роговиц консервированных при гипотермии у реципиентов с повторной кератопластикой (Борзенок С.А., 2008). При этом у пациентов в опытной группе процесс был менее выраженным и к 12 месяцам составил 14,1%.

    Таким образом, впервые показана клиническая эффективность сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба, обладающих иммуносупрессивными и толерогенными свойствами, за счет функциональной активности ММСК, в профилактике отторжения донорских роговиц при сквозной кератопластике высокого риска.

    Результаты сотрансплантации аллогенных фрагментов лимба, подготовленных по разработанной технологии, обладающих выраженными иммуносупрессивными свойствами и способствующих поддержанию и активизации процессов физиологической регенерации, значительно расширяют область их использования. В настоящее время получены убедительные данные применения технологии при кератопротезировании на ожоговых бельмах и при оптико-реконструктивных операциях с имплантацией иридо-хрусталиковой диафрагмы при аниридии, сопровождающихся, как известно, проградиентным воспалительным состоянием и нарушением процессов физиологической регенерации роговицы. По нашему мнению, дальнейшие исследования должны быть направлены на возможность применения данной технологии и при других оперативных вмешательствах и заболеваниях глаз, связанных с хроническим, вялотекущим, рецидивирующим воспалительным и аутоиммунным процессом, как то, увеиты и глаукома.


Страница источника: 101

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru