Online трансляция


Всероссийская научно-практическая конференция
Новые технологии в офтальмологии
Новые технологии в офтальмологии
Казань, 13-14 апреля 2017 г.



Межрегиональный круглый стол
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Новосибирск, 19 апреля 2017 года с 12:00 до 14.00 по Московскому времени

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 24 2017
№ 23 2016
№ 22 2016
№ 21 2016
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 1 2017
№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№1 (33) Март 2017
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

3.2.Результаты разработки технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами


1----------

     Как было показано при анализе литературы, консервация, как гипотермическая, так и органотипическая (нормотермическая) способствует снижению иммуногенности органов и тканей, кроме того к 14 суткам консервации происходит естественная элиминация антигенпрезентирующих клеток (АПК) и лимфоцитов-пассажиров из ткани трансплантата [29, 120, 56]. Кроме того, органотипическая консервация, являющаяся эквивалентом культивирования клеток, способствует не только сохранению жизнеспособности клеток фрагмента лимба, но и увеличению клеточной массы, а также повышению их функциональной активности. Таким образом, целью разработки технологии органотипической консервации явилось сохранение жизнеспособности и фенотипа ММСК фрагмента лимба в процессе консервации, а также увеличение клеточной массы в толще АФЛ и определение динамического изменения профиля цитокинов и растворимой молекулы HLA-G5, выделяемых в консервационную среду. Учитывая, что в настоящее время отсутствуют данные по составам сред для органотипической консервации ММСК АФЛ, было проведено исследование сохранения жизнеспособности и функциональной активности клеток фрагмента лимба в 3-х различных составах.


    В процессе изучения оптимального состава среды и сроков органотипической консервации, при которых максимально полно сохраняются жизнеспособные клетки в ткани АФЛ и проявляется их пролиферативная активность, в качестве средства для визуального мониторинга использовалась световая микроскопия. Результаты световой микроскопии динамического наблюдения за АФЛ в процессе органотипической консервации представлены на рис. 6: на сроках 7 суток (рис. 6А), 14 суток (рис. 6Б) и 21 сутки (рис. 6В, Г). Сроки выведения из эксперимента обусловлены следующими моментами:


    1. консервация менее 14 суток нецелесообразна, так как период элиминации АПК и лимфоцитов из ткани по данным литературы составляет именно эти сроки [120, 56];


    2. на 28 сутки клеточная масса достигала максимального уровня, отмечалось образование сплошного монослоя клеток вокруг АФЛ;


    3. к 35 суткам заметного наращивания клеточной массы не отмечалось, вероятно, по причине «контактного торможения».


     Как видно на рис. 6, наблюдалась пролиферативная активность клеток АФЛ, которые при выходе из ткани проявляли свои адгезивные свойства и образовывали монослой. Отмечено, что в процессе консервации АФЛ в исследуемых составах сред для консервации образуется монослой двух морфологически различных типов клеток: эпителиальных и ММСК (рис. 6Г), что подтверждает сохранность их жизнеспособности и стабильность фенотипа.


    При разработке технологии первичной органотипической консервации АФЛ, выборе оптимального состава сред и сроков консервации, при которых будет накоплено максимальное количество клеток в толще АФЛ, проводился рутинный морфометрический метод подсчета клеток в препаратах АФЛ, зафиксированных на контрольных сроках: 0, 14, 28 и 35 суток. Количество клеток в срезах АФЛ толщиной 5 мкм, при использовании разных составов сред представлено в табл. 8.


    Из таблицы видно, что при относительно равномерном увеличении количества клеток к 14 суткам органотипической консервации в ткани фрагментов лимба во всех группах исследования, к 28 суткам инкубации в АФЛ III-й группы их количество критически уменьшалось, вплоть до полной элиминации к 35 суткам.


    На рис. 7 представлены гистологические препараты АФЛ на различных сроках консервации, демонстрирующие динамику накопления клеточной массы в I-й группе АФЛ, консервируемых в среде Борзенка-Мороз (рис.7 А, Б, В), и практически полную элиминацию клеток из толщи АФЛ в III-й группе исследования (рис.7 Е), а именно консервации в культуральной среде обогащенной ростовыми факторами (EGF, cholera toxin, диметилсульфоксид).


    Сравнительное изучение результатов консервации АФЛ в трех различных составах консервационных сред показало непригодность состава среды III-й группы для длительных сроков органотипической консервации и поэтому дальнейшие исследования морфофункционального состояния АФЛ из этой группы не поводились.


     Таким образом, один аллогенный фрагмент лимба с размерами 0,5х2,0х8,0мм, прошедший первичную органотипическую консервацию в средах Борзенка-Мороз или стандартной, используемой для культивирования ММСК, в течение 28 суток содержит около 70000 клеток.


    Для определения функционального состояния клеток АФЛ в процессе органотипической консервации, был проведен анализ изменения цитокинового профиля в аликвотах сред на протяжении 35 суток.


    В качестве «точки отсчета» для возможности фиксирования изменений содержания, исследуемые цитокины были определены в «интактных» средах I и II групп исследования.


    Сравнительный анализ цитокинового профиля инкубационной среды в процессе ее замены, представленный в табл. 9, позволил определить, что при консервации АФЛ в средах I-й и II-й групп происходит повышение содержания противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGFβ), также HLA-G5, и снижение провоспалительных (IFNγ, TNFα) (рис. 8). Колебания содержания IL-6 были незначительными, что может свидетельствовать не столько о провоспалительном профиле клеток АФЛ в процессе консервации, сколько о сохранности и функциональной активности ММСК-подобных клеток лимба, так как доказано, что ММСК костного мозга вырабатывают IL-6 для самоподдержания их в недифференцированном состоянии [176].


    На рис. 8 наглядно продемонстрировано отсутствие существенных различий в концентрациях исследуемых цитокинов в сравниваемых группах, что позволяет равноценно использовать как стандартную среду для консервации ММСК (группа II), так и среду Борзенка-Мороз (группа I).


    Полученные данные позволяют определить, что в процессе органотипической консервации АФЛ с 21 суток наблюдается стабилизация цитокинового баланса с преобладанием противовоспалительных и иммуносупрессивных при отсутствии повышения уровня провоспалительных цитокинов. На основании этого можно заключить, что оптимальными сроками органотипической консервации АФЛ являются 21-28 сутки, когда происходит достаточное накопление клеточной массы в структуре АФЛ и стабилизация цитокинового баланса в сторону супрессии.


    Подтверждением этого послужили данные об усилении экспрессии маркеров ММСК и HLA-G-рецепторов в клетках АФЛ в процессе органотипической консервации на 28 сутки.


     Иммуногистохимическое окрашивание клеток нативных препаратов АФЛ и АФЛ на 28 сутки органотипической консервации в средах I-й и II-й групп подтвердило не только сохранность лимбальных клеток с фенотипом ММСК, но и выявило увеличение активности маркеров ММСК и HLA-G-рецепторов по сравнению с исходным уровнем.


    Использование моноклональных антител для оценки экспрессии маркеров ММСК (СD105, CD90, CD44, CD29) и мембрано-цитоплазматический маркер HLA-G-рецепторов в клетках препаратов АФЛ позволило установить низкую экспрессию их (слабое зеленое свечение) в нативных препаратах АФЛ до консервации (рис. 5) и резкое усиление экспрессии этих маркеров к 28 суткам консервации (рис. 9), которое происходило на фоне увеличения пролиферативной активности клеток АФЛ и повышения уровня противовоспалительных и иммуносупрессирующих цитокинов (IL-10, IL-1RA, TGFβ).


    Отмечается яркое зеленое свечение маркеров ММСК (CD90, CD105, CD29, CD44) и HLA-G-рецепторов, при этом отсутствует реакция с маркером гемопоэтических клеток (CD45).


    Таким образом, установленные нами факты подтверждают, что в клетках АФЛ при консервации в нормотермических условиях в среде Борзенка-Мороз (I группа) и в стандартной, используемой для культивирования ММСК (II группа) в течение 28 суток, сохраняются не только их жизнеспособность и пролиферативная активность, но также сохраняются и активизируются их «стволовые» и толерогенные свойства, сопровождающиеся элиминацией клеток Лангерганса и лимфоцитов из АФЛ в процессе органотипической консервации.


    Для подтверждения стабильности фенотипа пролиферирующих клеток АФЛ был проведен иммунофенотипический анализ ММСК-подобных клеток АФЛ, образовавших монослой за 28 суток в процессе органотипической консервации в I-й (среда Борзенка-Мороз) и II-й (стандартная культуральная) группах исследования.


     Результаты анализа, представленные на рисунках 10, 11 и в табл. 10, демонстрируют практически однородный состав клеточной культуры и иммунофенотип, подобный мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам.


    Наличие позитивной реакции с маркерами ММСК (CD105, CD90, CD29, CD44) и негативной с маркером лейкоцитарной группы клеток – CD45, а также определение позитивной реакции с маркером HLA-G на поверхности исследуемых культур клеток подтверждает сохранение фенотипа ММСК в ткани АФЛ в процессе первичной органотипической консервации, не только в стандартной, используемой для культивирования ММСК, но и в среде Борзенка-Мороз. Показано, что использование среды Борзенка-Мороз, разрешенной для клинического применения на территории РФ, для органотипической консервации АФЛ позволяет не только сохранить жизнеспособность и сохранность имммунофенотипа клеток АФЛ в течение не менее чем 35 суток, но и поддержать их пролиферативную активность.


    Таким образом, разработана технология предоперационной подготовки аллогенных фрагментов лимба, включающий хирургическое выделение лимбальных фрагментов из донорских глаз в сроки до 18 часов после смерти, последующей органотипической консервацией в течение 21-28 суток с использованием равноценно как стандартной среды, применяемой для культивирования ММСК, так и среды Борзенка-Мороз.


Страница источника: 61

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru