Online трансляция


Всероссийская научно-практическая конференция
Новые технологии в офтальмологии
Новые технологии в офтальмологии
Казань, 13-14 апреля 2017 г.



Межрегиональный круглый стол
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Новосибирск, 19 апреля 2017 года с 12:00 до 14.00 по Московскому времени

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 24 2017
№ 23 2016
№ 22 2016
№ 21 2016
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 1 2017
№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№1 (33) Март 2017
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

2.1.Характеристика материалов и методов исследования на доклиническом этапе


1----------

     2.1.1. Общая характеристика материала на доклиническом этапе исследований

    Распределение донорского материала использованного на доклиническом этапе работы представлено в таб. 1.

    2.1.2. Разработка технологии первичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба с иммуносупрессивными свойствами

    С целью определения оптимального состава консервационной среды было проведено сравнительное изучение морфологических и функциональных изменений в процессе органотипической консервации АФЛ в трех различных составах консервационных сред в течение 35 суток.

    Для достоверности полученных результатов были взяты АФЛ от 4-х доноров в количестве 48 АФЛ (по 6 АФЛ с одного донорского глазного яблока) и равноценно разделены на 3 группы. Расход донорского материала и сроки наблюдения представлены в табл.2.

    При этом в общей сложности 48 лимбальных фрагментов были выделены из 8 глазных яблок от 4 трупов-доноров роговиц.

    Дополнительно по 1 АФЛ от каждого донора были зафиксированы в 5% формальдегиде и использовались в качестве контроля. Далее оставшиеся АФЛ (n=44) помещались в культуральные флаконы объемом 25 см3 («Corning», США) по 3 АФЛ во флакон от одного донора. В зависимости от группы исследования во флаконы было добавлено по 4 мл соответствующей среды:

    I группа – АФЛ (n=12) подверглись органотипической консервации с использованием среды Борзенка-Мороз для консервации роговицы [8]: среда 199 на солях Хенкса с глутамином, с добавлением: декстран 40.000 – 50 г/л, L-глутамин - 1,5 г/л, HEPES - 15 mМ, Na-бикарбонат 7,5%-раствор – 10 ммоль/л, глюкоза 40%-раствор – 300 мг/л, пенициллин - 10000 ЕД/мл, стрептомицин - 10000 ЕД/мл, амфотерицина В - 1,25 мг/мл, в которую дополнительно был добавлен инсулин - 0,4 мкМ, дексаметазон - 10 нМ и 2% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США);

    II группа – АФЛ (n=12) подвергались органотипической консервации в стандартной среде для культивирования ММСК [28], состав среды: DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), L-глутамин - 0,58 г/л, HEPES - 10 mМ, пенициллин - 10000 ЕД/мл, стрептомицин - 10000 ЕД/мл, амфотерицина В - 1,25 мг/мл, инсулин - 0,4 мкМ, дексаметазон - 10 нМ и 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США);

    III группа – АФЛ (n=12) подвергались органотипической консервации в среде, используемой для культивирования лимбальных эпителиальных клеток [179], состав среды: DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), HEPES 10mM, L-глутамин - 0,58 г/л, ИТС (х50) (инсулин 5 нг/мл-трансферрин 5 нг/мл-селенит 5 нг/мл) (1:100), дексаметазон 3 нг/мл, гентамицин 50 нг/мл (ПанЭко, Россия), амфотерицин В 1,25 нг/мл, cholera toxin – 30 нг/мл (Biomol Exeter, Великобритания), EGF – 2 нг/мл (ПанЭко, Россия),с добавлением 0,5% диметилсульфоксида (ДМСО) и 5% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США).

    Условия органотипической консервации в каждой группе: при t 37°С, 5%-содержании СО2 и 95% влажности (СО2- инкубатор «Sanyo», Япония) в течение 35 суток, замена консервационной среды проводилась каждые 3 суток. Динамическое наблюдение за пролиферативной активностью клеток АФЛ в процессе консервации проводилось с помощью инвертированного микроскопа «Leica» (Германия), в режиме фазового контраста.

    На 14, 28 и 35 сутки по одному АФЛ из каждой группы исследования фиксировали 5% раствором формальдегида, далее подвергали гистологической проводке по стандартной методике с окрашиванием парафиновых срезов гематоксилин-эозином.

    Морфологические исследования, проводимые в эти сроки, имели цель выявить увеличение количества ядросодержащих клеток в толще АФЛ, которое затем определяли рутинным методом подсчета в срезах АФЛ.

    С целью определения оптимальных сроков органотипической консервации АФЛ с иммуносупрессивными свойствами проводились ниже следующие исследования.

    Для определения оптимальных сроков органотипической консервации АФЛ использовали составы сред I и II групп исследования.

    Сравнительный анализ динамического изменения профиля исследуемых цитокинов и HLA-G5, определение фенотипа клеток АФЛ, степень сохранности фенотипа клеток АФЛ в процессе органотипической консервации проводился после консервации лимбальных фрагментов в 2-х составах сред:

    I группа, среда по прописи Борзенка-Мороз с добавлением инсулина, дексаметазона и фетальной бычьей сыворотки.

    II группа, стандартная культуральная, используемая для культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток костного мозга.

    При проведении эксперимента были исследованы морфо-функциональные изменения клеток АФЛ (n=60), полученных от 5-ти доноров, равноценно разделенные на две группы, распределение материала представлено в таблице 3. При этом по 2 АФЛ от каждого донора были зафиксированы в 5% формальдегиде и использовались в качестве контроля. Оставшиеся АФЛ (n=50) после иссечения были помещены в культуральные флаконы объемом 25 см3 («Corning», США) по 5 АФЛ во флакон от одного донора. В зависимости от группы исследования во флаконы было добавлено по 4 мл соответствующих сред, составы которых были изложены выше.

    При этом в общей сложности 60 лимбальных фрагментов были выделены из 10 глазных яблок от 5 трупов-доноров роговиц.

    АФЛ в каждой группе исследования подвергались органотипической консервации в условиях СО2-инкубатора при t 37°С, 5%-содержании СО2 и 95% влажности в течение 35 суток, замена консервационной среды проводилась каждые 3 суток.

    Образцы консервационной среды были заморожены при t – 20?С, для дальнейшего исследования на содержание в них провоспалительных (IL-6, IFN-γ, TNF-α), противовоспалительных (IL-10, IL-1RA, IL-4, TGF-β) цитокинов и растворимой молекулы HLA-G5 методом иммуноферментного анализа.

    Динамическое наблюдение за пролиферативной активностью клеток АФЛ в процессе консервации проводилось в режиме фазового контраста с помощью инвертированного микроскопа «Leica» (Германия).

    АФЛ из каждой группы исследования на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки были фиксированы в 5% растворе формальдегида, для дальнейшего гистологического и иммуногистохимического исследования срезов АФЛ и определения фенотипа клеток АФЛ с использованием моноклональных антител мыши: к HLA-G-человека (ab 76869, Abcam, UK), панелью маркеров мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток: CD90-, CD44-, CD45-, CD105-, CD29-человека (ab 93758, Abcam, UK).

    Для дополнительного определения сохранности фенотипа ММСК клеток АФЛ в процессе органотипической консервации клетки, мигрировавшие из ткани АФЛ и образовавшие монослой, были исследованы методом иммунофенотипирования на проточном цитофлуориметре «Beckman Coulter Cytomics FC 500» (Германия) с использованием набора маркеров к мембранным белкам (CD11, СD34, CD44, CD45, CD 105, CD19, CD90, CD29, HLA-G).

     2.1.3. Разработка технологии кригенной консервации аллогенных фрагментов лимба

    С целью изучения возможности создания банка криоконсервированных АФЛ – от 8-ми доноров-трупов были отобраны жизнеспособные АФЛ, прошедшие стадию органотипической консервации в течение 28 суток по разработанной технологии. Все АФЛ были разделены на 2 группы:

    I группа – АФЛ замораживали в среде №1: DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), HEPES 10mM, L-глутамин 0,58 г/л, инсулин 0,4 мкМ, дексаметазон 10нМ, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В, с добавлением 30% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) [126].

    II группа – АФЛ замораживали в среде №2: DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), HEPES 10mM, L-глутамин 0,58 г/л, инсулин 0,4 мкМ, дексаметазон 10нМ, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В.

    На 26 сутки органотипической консервации среду меняли на свежую для сохранения высокого уровня митотической активности клеток. Через сутки АФЛ помещали в криопробирки, добавляли по 1,5 мл среды №1 или №2, в зависимости от группы исследования. Замораживание проводили по стандартной методике для соматических клеток. 16 образцов АФЛ (по 8 в группах I и II) хранили при t –80°С в морозильной камере («Sanyo», Япония) в течение 1, 3, 6 и 9 месяцев, еще 16 образцов АФЛ (по 8 в группах I и II) при –196°С в течение 6, 12, 18 и 24 месяцев. Расход материала и объем проведенных исследований представлены в таблице 4.

    В указанные сроки дефростацию проводили на водяной бане при t 37°C, криопротектор удалялся отмыванием АФЛ в стерильном физиологическом растворе в 3-х сменах.

    По 16 образцов АФЛ из I-й и II-й групп фиксировали в 5% растворе формальдегида для морфологического исследования.

    2.1.4. Разработка технологии вторичной органотипической консервации аллогенных фрагментов лимба после дефростации

    Для определения оптимальных сроков вторичной органотипической консервации АФЛ после размораживания исследовано 16 образцов, из них 4 – криоконсервированных при t -80°С в лабораторном морозильнике («Sanyo», Япония) в течение 6-ти и 9-ти месяцев в среде №1 с криопротектором; 4 – контрольных, криоконсервированных при t -80?С в среде №2 без криопротектора; 4 –консервированных при –196?С в течение 12 и 24 месяцев в среде №1 с криопротектором; 4 – контрольных, криоконсервированных при -196?С в среде №2 без протектора. После дефростации образцы АФЛ помещались в культуральные флаконы объемом 25 см3 («Corning», США), заливались средой для органотипической консервации и инкубировались при t 37°C в атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности в течение 21суток.

    Аликвоты сред в процессе вторичной органотипической консервации отбирались в разные сроки и хранились при t -20?С для дальнейшего исследования на содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и растворимой молекулы HLA-G5 методом ИФА.

    Для определения сохранности фенотипа ММСК АФЛ после дефростации и вторичной органотипической консервации монослой клеток, образовавшийся на 21 сутки, был исследован методом иммунофенотипирования.

    2.1.5. Характеристика методов исследования на доклиническом этапе

    Световая микроскопия

    Световая микроскопия (визуализация и фотосъемка) препаратов АФЛ на различных этапах экспериментальных исследований, а именно гистологических парафиновых срезов АФЛ, окрашенных гемотоксилин-эозином по стандартной методике, проводилась на световом микроскопе «Leica» (Германия), оснащенном цифровой камерой «Leica» (Германия).

    Определение содержания цитокинов (IL-10, IL-1RA, IL-4, IL-6, IFNγ, TNFα, TGFβ) и молекулы HLA-G5 в аликвотах среды и слезной жидкости методом иммуноферментного анализа

    Спектр исследования определялся несколькими известными положениями: индукторной ролью IFNγ и IL-4 в развитии клеточных, в частности, аутоиммунных, аллергических и противоинфекционных реакций; провоспалительных и хемотаксических цитокинов – TNFα, IL-1?, антагонистами которых являются IL-10, IL-1RA, TGFβ – обладающие выраженными противовоспалительными и иммуносупрессивными свойствами [24]. А также данными, описанными в главе 1 (обзор литературы), о присутствии ряда цитокинов и растворимой молекулы толерогенности HLA-G5 во влаге передней камеры и слезной жидкости и изменении их содержания при развитии патологических процессов.

    Основными проявлениями биологической активности IL-6 в организме являются: активация пролиферации Т- и В-лимфоцитов, провоспалительное действие за счет активации экспрессии молекул адгезии на эндотелии и хемотаксиса некоторых типов лейкоцитов, усиления функциональной активности фибробластов и остеокластов, активация острофазового ответа путем индукции синтеза в печени С-реактивного белка, а также пирогенное действие [140]. Однако следует отметить, что IL-6 также вырабатывается ММСК и является необходимым для поддержания их в недифференцированном состоянии [176].

    Оценку уровней цитокинов (IL-10, IL-1RA, IL-4, IL-6, IFNγ, TNFα, TGFβ) и растворимой молекулы HLA-G5 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург), предназначенных для количественного определения цитокинов человека в биологических образцах, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

    Минимальные, достоверно определяемые набором концентрации исследуемых цитокинов в образцах составили от 5 до 20 пг/мл. Измерения проводили на планшетном анализаторе «Униплан» при 450 нм.

    При определении содержания исследуемых цитокинов в кондиционированных средах за исходные данные было принято содержание их в «интактных» средах.

    Забор слезы у реципиентов проводили автоматической пипеткой «Ленпипет» (10-100 мкл) из нижнего свода коньюнктивальной полости в количестве 50-100 мкл (50 мкл максимальное количество слезы, которое удавалось получить у некоторых реципиентов с сопутствующим синдромом сухого глаза) перед операцией, на 1, 4, 7 сутки, а также в 1 и 3 месяцы после операции.

    Учитывая отсутствие нормативных данных уровня исследуемых цитокинов в слезной жидкости (СЖ), были проведены исследования относительно здоровых доноров (n=10) и определен уровень цитокинов, принятый за физиологическую норму: IL-10 (до 50 пг/мл), IL-1RA (150-260 пг/мл), IL-4 (19-28 пг/мл), IL-6 (26-32 пг/мл), IFNγ (до 100 пг/мл), TNFα (18-24 пг/мл), TGFβ (до 230 пг/мл), HLA-G (36-64 пг/мл).

    Метод иммуногистохимии клеток АФЛ

    Выявление фенотипа ММСК АФЛ и их толерогенного состояния проводили методом иммуногистохимического окрашивания.

     Для нейтрализации аутофлуоресцентного свечения ткани АФЛ предварительно депарафинизированные в спиртах по стандартной методике срезы АФЛ обрабатывали синькой Эванса в разведении 1:100 в течение 5 минут, затем трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Далее инкубировали при комнатной температуре в условиях водяной бани t 37С° с первичными моноклональными антителами (табл. 5) в соответствующих разведениях в течение 1 часа:

    Далее срезы АФЛ отмывали 3-х кратно в PBS и наносили видоспецифичные вторичные антитела, меченные Alexa Fluor в разведении 1:500, инкубировали в тех же условиях в течение 1 часа. Стекла со срезами отмывали 3 раза в PBS, фиксировали в 10% растворе формальдегида и заключали в глицерин под покровное стекло. Фотосъемку препаратов проводили на микроскопе Axiovert-25 Carl Zeiss при увеличении х200 и х400 с использованием цифровой фотокамеры Axiocam color фирмы Carl Zeiss, Германия.

    Метод иммунофенотипирования клеток АФЛ

    Для подтверждения стабильности фенотипа в процессе консервации проводили иммунофенотипирование клеток, вышедших из ткани АФЛ и образовавших монослой. Иммунофенотипирование - это определение поверхностных маркеров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Поскольку антитело конъюгировано с флуорохромом, можно визуализировать экспрессию анализируемого маркера и оценить ее качественно и количественно – с помощью метода проточной цитофлуориметрии.

    Клетки отмывали от консервационной среды раствором Версена, обрабатывали 0,25% раствором трипсина, после чего инактивировали действие фермента добавлением среды, подсчитывали количество клеток в камере Горяева и центрифугировали суспензию (7 мин, 1000об/мин, 100g). К полученному осадку добавляли 900 мкл раствора фосфатно-солевого буфера (PBS с рН=7,4) и аликвотировали по 100 мкл. К каждой пробе добавляли антитела (10 мкл антител на 1?106 клеток) (табл. 6), конъюгированные с флуоресцентными метками (FITC – fluorescein isothiocyanate, PE – phycoerythrin, PC5 Phycoerythrin-Cyanin 5.1 и ECD – Phycoerythrin-Texas Red-X), и инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте.

    После этого пробы центрифугировали (400 g, 5 мин), осадок ресуспендировали в 1 мл PBS (рН=7,4) с 1% FCS и переносили в пробирки для проточного цитофлуориметра (Beckman coulter FC 500, США). Полученные результаты анализировали на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с помощью программы «CXP analysis».

    Электронно-микроскопические исследования

    Изучение ультраструктуры и архитектоники АФЛ на этапе разработки технологии криогенной консервации проводилось с помощью сканирующей электронной микроскопии.

    Для этого полученные ранее парафиновые срезы АФЛ проводили по ряду восходящих спиртов (40?, 50?, 70?, 96?, 100?) по 7-10 минут в каждом растворе и обезвоживали в ацетоне для депарафинизации. Далее препараты высушивались при комнатной температуре в течение 5 мин, покрывались золотом (толщина слоя 7 нм) с помощью напылительной установки SPI-MODULE Sputter Coater (SPI Supplies, США), монтировались двухсторонним скотчем к алюминиевому столику и анализировались с помощью сканирующего электронно-ионного микроскопа “Quanta 200 3D” (FEI Company, США). Анализ препаратов осуществлялся в режиме высокого вакуума и напряжении 10 кВ. Данная технология позволяла не нарушать архитектонику и морфометрию клеток и давала возможность проводить исследование объектов в режиме естественной среды.


Страница источника: 36

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru