Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Разработка технологии предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
2Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук

    Актуальность. В связи с ограниченной эффективностью методов лечения дистрофических заболеваний сетчатки в последние годы широко ведутся экспериментальные разработки в области хирургической реконструкции слоя ретинального пигментного эпителия. Известно несколько форм использования пигментного эпителия для трансплантации — в виде суспензии клеток, в составе тканевых трансплантатов заднего отрезка глаза, в виде 2D-культуры клеток на плоских субстратах, а также в виде 3D-культуры клеток на трехмерных микроносителях.
    Один из методов регенеративной медицины — метод формирования бессубстратных 3D-клеточных агрегатов (сфероидов) — позволяет поддерживать жизнеспособность эксплантируемых клеток, контролировать процесс эпителиально-мезенхимальной трансформации, ограничивать миграцию клеток из сфероида в трансплантационное ложе реципиента, а также является более простым и воспроизводимым по сравнению с методом матричных культур. В литературе нами не обнаружено данных о применении клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия для регенерации слоя пигментного эпителия сетчатки.
    Цель. Разработать протокол предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом клеточного 3D-культивирования и изучить микроскопически динамику изменения его морфологии in vitro.
    Материал и методы. В качестве источника клеток донорского ретинального пигментного эпителия использовали глазные яблоки доноров-трупов без корнеолимбальных дисков, удаленных для целей трансплантации роговицы (2 глаза, 1 донор). Радужная оболочка, цилиарное тело, хрусталик, стекловидное тело и нейральная часть сетчатки удалялись. Глазной бокал заполняли раствором Хэнкса с ионами Ca2+ и Mg2+ и инкубировали при стандартных условиях в течение 20 минут. После инкубации раствор из глазного бокала центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин. Осадок разбавляли 2 мл питательной среды на основе полной ростовой среды DMEM/F12 и инкубировали в чашке Петри с регулярной сменой среды при стандартных условиях до получения монослоя клеток, после чего клетки снимали с поверхности раствором 0,25% трипсина, центрифугировали, а к образовавшемуся осадку добавляли такое количество питательной среды, чтобы получить концентрацию 500 клеток на 20 мкл раствора. Образцы полученной разбавленной суспензии объемом 20 мкл в форме капли переносили на внутреннюю поверхность сухой крышки чашки Петри (до 16 образцов на одной крышке) и инкубировали при стандартных условиях в положении «каплями вниз» с регулярной заменой среды.
    Проводили микроскопическое наблюдение за поведением клеток в культурах, фотографирование и обработку цифровых изображений, а также оценку динамики формы и размеров образующихся сфероидов в течение 7 суток.
    Результаты. Изначально было получено 70 висячих капель, содержащих взвесь клеток ретинального пигментного эпителия. В первые 12 часов в каждой капле отмечалось уменьшение видимой площади клеточной массы с формированием сфероидов, морфологически отличающихся по двум признакам — по четкости контура и по размеру сформировавшихся агрегатов. 49 сфероидов имели «гладкие» контуры, 21 — «бахромчатые». В 34 каплях сформировался один большой сфероид (>150 мкм, 9 «бахромчатых» и 25 «гладких») в сопровождении нескольких сфероидов малой величины (<50 мкм), а в 36 — группа из нескольких сфероидов среднего размера (50-150 мкм, 12 «бахромчатых» и 24 «гладких»). Спустя 36 часов количество висячих капель со сфероидами среднего размера и «гладкой» морфологии уменьшилось с 24 до 10 — некоторые из них слились в крупные агрегаты с «гладкой» поверхностью. К концу вторых суток культивирования 3 крупных «гладких» сфероида приобрели «бахромчатость». В одном случае на 4 сутки «бахромчатые» сфероиды среднего размера подверглись полному распаду с формированием взвеси клеток и дебриса. При дальнейшем наблюдении морфология сфероидов не менялась. Случаев перехода «бахромчатых» сфероидов в «гладкие» отмечено не было. Средний размер крупных сфероидов с «гладкой» морфологией на 5 день составил 217±5,5 мкм. Все сфероиды обладали выраженной пигментацией, а составляющие их клетки имели преимущественно мезенхимальный фенотип.
    Выводы. Представленный протокол позволяет эксплантировать клетки ретинального пигментного эпителия из трупных донорских глаз и формировать из них клеточные сфероиды, обладающие заданными параметрами. Мы считаем, что сроки 3D-культивирования 24-48 часов являются оптимальными для формирования клеточных агрегатов, подходящих для трансплантации. Выделены морфологические варианты сфероидов, которые при дальнейшем исследовании могут служить косвенными ориентирующими признаками при их отборе для трансплантации. Мы предполагаем, что наибольшим регенераторным потенциалом должны обладать сфероиды с «гладкой» поверхностью, что подтверждается их пластичностью и способностью сливаться друг с другом.


Страница источника: 163

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru