Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Разработка метода терапии аденовирусной офтальмоинфекции с помощью РНК-интерференции


1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
2Heinrich Pette Institute Leibniz Institute for Experimental Virology
3МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ

    Актуальность. К аденовирусной офтальмологической инфекции относят аденовирусный конъюнктивит — воспаление слизистой оболочки глаза конъюнктивы, и аденовирусный эпидемический кератоконъюнктивит — сочетанное воспаление конъюнктивы и роговицы. В России эпидемическим кератоконъюнктивитом ежегодно страдают более 300000 человек. Наиболее тяжелые поражения глаз вызывают аденовирусы, относящиеся к группе D (типы 8, 19, и 37).
    Эпидемический характер распространения, многообразие клинических проявлений, большие потери по временной нетрудоспособности, временная или стойкая утрата зрения определяют аденовирусную инфекцию как серьезную проблему современной офтальмологии.
    Слабая эффективность общепринятых подходов к лечению аденовирусной инфекции диктует необходимость поиска новых этиологически обоснованных методов терапии и разработки лекарственных средств с избирательным механизмом действия на возбудителей данного заболевания. ДНК-полимераза аденовируса играет ключевую роль в процессах репликации вирусного генома, а также продуктивного развитии инфекции и поэтому может стать потенциальной мишенью для разрабатываемых терапевтических препаратов.
    Цель. Разработка подхода для эффективного подавления экспрессии гена ДНК-полимеразы аденовирусов группы D с помощью РНК-интерференции.
    Материал и методы. Модельные клетки, в которых осуществляется экспрессия гена ДНК-полимеразы аденовируса человека типа 36 группы D (pol-D36), были получены путем трансдукции клеток линий А549 и Н1299 (клетки карциномы легкого человека) лентивирусными векторами, содержащими целевой ген pol-D36 и маркерный ген красного флуоресцентного белка tdTomato, разделенные последовательностью IRES. Мы синтезировали три типа малых интерферирующих РНК (siРНК-pol-1, siРНК-pol-2 и siРНК-pol-3), комплементарных последовательностям мРНК ДНК-полимеразы аденовирусов человека группы D типов 8, 19, 36 и 37, а также контрольную siРНК-Scramble, последовательность которой не имеет гомологии с известными мРНК человека и мыши. На основе последовательностей siРНК с самым высоким уровнем подавления экспрессии целевого гена pol-D36 и контрольной siРНК-Scramble были сконструированы лентивирусные векторы, кодирующие малые шпилечные РНК (shРНК-pol-1 и shРНК-Scramble).
    Изменение уровня экспрессии целевого гена pol-D36 оценивали методами проточной цитофлуориметрии (по уровню флуоресценции маркерного белка tdTomato) и ПЦР в реальном времени. Количество белка ДНК-полимеразы аденовируса человека типа 36 оценивали методом Вестерн-блота. Количество копий вирусных геномов определяли методом ПЦР в реальном времени.
    Результаты. Исследование эффективности действия siРНК показало, что через 48 часов после трансфекции модельных клеток уровень флуоресценции белка tdTomato снижался на 64-68% при использовании siРНК-pol-1 и на 50-55% под действием siРНК-pol-2 и siРНК-pol-3 по сравнению с контролем. Количество мРНК pol-D36 снижалось на 77-80%, 60-62% и 49-52% при использовании siРНК-pol-1, siРНК-pol-2 и siРНК-pol-3 соответственно по сравнению с контролем.
    Было показано, что спустя 14 дней после трансдукции модельных клеток лентивирусными векторами, несущими shРНК-pol-1, происходит снижение экспрессии мРНК pol-D36 на 72-81% и уменьшение количества белка ДНК-полимеразы аденовируса человека типа 36 на 70-75% по сравнению с контролем.
    Было исследовано ингибирующее действие shРНК-pol-1 на репликацию аденовирусов. Через 6 дней после инфекции аденовирусами человека типов 8 и 37 клеток линии Н1299, в которых осуществляется экспрессия shРНК-pol-1, наблюдалось подавление репликации на 92% и 90% соответственно по сравнению с контролем.
    Выводы. Нами создана модельная система, позволяющая оценивать эффективность различных ингибиторов в отношении ключевого фактора репликации аденовирусов — вирусной ДНК-полимеразы.
    Мы разработали высокоэффективный и специфичный подход антивирусной терапии, основанный на ингибирующих свойствах малых интерферирующих РНК, и показали существенное снижение уровня экспрессии целевого гена.


Страница источника: 158
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru