Online трансляция


Научно-практическая конференция с международным участием
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Москва. Гостиница Holiday Inn Sokolniki
4 февраля 2017 г.



15-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Сочи, 16-17 марта 2017
Официальный сайт

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 22 2016
№ 21 2016
№ 20 2015
№ 19 2015
№ 18 2015
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
№ 2 (28) Апрель 2016
№ 1 (27) Март 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Технология культивирования мезенхимальных стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения


1Калужский филиал «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии»
2Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифософского
3МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ

    Проблема восстановления функции необратимо поврежденных органов и тканей путем трансплантации органов и клеток разрабатывалась на протяжении всего XX века. В результате многочисленных исследований и наблюдений стало очевидным, что с помощью методов клеточной трансплантации появляется возможность возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах и увеличения пула функционирующих клеток. Стволовые клетки также способствуют активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации.

    В офтальмологии в условиях эксперимента стволовые клетки применяли при травматических повреждениях и органических заболеваниях сетчатки экспериментальных животных.

    Было исследовано влияние стволовых клеток: на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений в сетчатке у крыс линии Campbell, на проявление каинатной оптиконейропатии, при лечении частичной атрофии зрительного нерва. В данных работах авторы показали, что стволовые клетки оказывали выраженное стабилизирующее влияние на процессы дегенерации и на органические изменения, происходило краткосрочное улучшение функций сетчатки, подтвержденное методами ЭРГ. Однако, все авторы описывают сложность визуализации клеток в экспериментах in vivo после трансплантации, а так же кратковременность эффекта, связанную с затруднением фиксации клеток в месте введения, их миграцией в другие отделы глаза.

    Предложены различные способы введения стволовых клеток при патологии сетчатки и зрительного нерва: внутривенное, субконъюнктивальное, субтеноновое, парабульбарное, интравитреальное, супрахориоидальное, введение в канал, образованный после радиальной оптической нейротомии. Однако, по данным литературы, большим преимуществом обладает метод субретинального введения, в связи с возможностью максимального приближения к месту повреждения, но, к сожалению, данный способ введения клеток также не исключает их миграции.

    В настоящее время популярным направлением становится использование магнитных технологий с целью фиксации стволовых клеток в месте их введения. Впервые с этой целью стволовые клетки с введенными в них магнитными наночастицами были использованы для движения стволовых клеток при внутривенном введении к области печени. Для этого крысам в области печени размещали внешний магнит, который «притягивал» введенные внутривенно клетки, где клетки в итоге и депонировались. Затем стволовые клетки с введенными в них магнитными наночастицами были использованы для движения к месту повреждения сосудов и сердца.

    В офтальмологии магнитные технологии с целью фиксации клеточного материала после введения не использовались.

    Таким образом, актуальным представляется разработка методики культивирования стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения.

    Цель — разработать технологию культивирования стволовых клеток с магнитными частицами для субретинального введения.

    Материал и методы. Первым этапом мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выращивали в культуре клеток костного мозга, взятого у GFP — мыши при помощи пункции из подвздошной кости (объем — до 0,1 мл). Выращивание культуры производили в специальном боксе для клеточных культур. Также использовались: центрифуга с одноразовыми стерильными центрифужными пробирками на 50 мл, термостат воздушный, ламинарный бокс, инвертированный и обычный микроскопы, автоматические пипетки, баллоны с углекислым газом и воздухом, камеры Горяева для подсчета концентрации клеток.

    Для культивирования клеток исходного костного мозга использовали стерильные одноразовые пластиковые культуральные флаконы с площадью дна в 25 и 150 см2. При размножении МСК использовали следующие среды и растворы: среда RPMI—1640, среда 199, антибиотики: пенициллин, амфотерицин, раствор L—глютамина, эмбриональная телячья сыворотка.

    За 12—14 последовательных удвоений (в течение 25—30 суток) из исходного количества недифференцированных МСК, содержащихся в полученном пунктате и составляющем примерно 103 клеток, продуцируется примерно (1—2) х107 МСК, необходимых для проведения успешной трансплантации стволовых клеток.

    Магнитные частицы (d=2,8 мкм) вводили в цитоплазму МСК по следующей методике. По достижении 80—90 % конфлюентности к культуре МСК добавляли суспензию магнитных частиц, которые предварительно обрабатывали поверхностно—активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки.

    Клетки инкубировали с частицами 24 ч в СО2— инкубаторе, после чего культуральную среду меняли и клетки 5—кратно отмывали от свободных магнитных частиц раствором Хенкса.

    Следующим этапом производилась оценка влияния магнитных частиц на пролиферативную активность стволовых клеток костного мозга методом МТТ теста. Для этого инкубированные в течение 72 часов клетки, содержащие магнитные частицы, высевались в 6—луночные планшеты с плотностью 50 тысяч клеток/лун. Затем в лунки вносили МТТ (0,25 мг/мл, Serva, Германия) и инкубировали в течение еще 3—х часов. Формазан эллюировали с помощью ДМСО в течение 30 мин при 37°С и проводили измерение оптической плотности эллюата на планшетном спектрофотометре Multiscan (Thermo Scientific) при длине волны 570 нм. Для просчета эллюат из одной лунки 6— луночной платы переносили на 3 лунки 96—луночного планшета в объеме 100 мкл для получения статистически более достоверных результатов.

    Также производилась оценка влияния магнитных частиц на функциональную активность стволовых клеток костного мозга путем оценки продукции ДНК и РНК с использованием флуоресцентных красителей. Для этого инкубированные в течение 72 часов клетки, содержащие магнитные частицы, высевались в 6—луночные планшеты с плотностью 50 тысяч клеток/лун. Затем в лунки вносили акридиновый желтый краситель и при помощи микроспектрофлуориметра производили определение соотношения зеленой люминесценции (530 нм), которая характерна для ДНК, к красной люминесценции (640 нм), которая характерна для РНК.

    Для оценки жизнеспособности адгезированных на пластике стволовых клеток с введенными в них магнитными частицами добавляли также акридиновый желтый краситель и эпидий бромид. Акридиновый желтый окрашивал живые и апоптотические клетки, а эпидий бромид — некротические. Было произведено соотношение живых и некротических клеток.

    Для проверки эффективности мечения материала суспензию клеток, содержащих магнитные частицы, помещали на чашку Петри, под дно которой подводили внешний магнит с напряженностью магнитного поля 10 мТл и рассматривали возможность миграции клеток.

    Результаты и обсуждение. По данным, полученным в результате проведения МТТ—теста, было показано, что проникновение магнитных частиц внутрь стволовых клеток незначительно (до 15 % через 72 часа инкубации), снижает пролиферативную активность. Это говорит о том, что жизнеспособность клеток при данной технологии составляет до 95 %.

    При добавлении к культуре клеток акридинового желтого красителя соотношение зеленой (ДНК) и красной (РНК) люминесценции было увеличено, что говорит о функциональной активности стволовых клеток, содержащих магнитные частицы.

    Также при добавлении акридинового желтого красителя и эпидия бромида к культуре стволовых клеток, содержащих магнитные частицы, соотношение живых клеток к некротическим показало жизнеспособность клеток до 95 %.

    При использовании внешнего магнитного поля с напряженностью 10 мТл была продемонстрирована эффективность мечения МСК магнитными частицами, она составила 90 %. При увеличении видно, что клетки, содержащие частицы в цитоплазме, мигрируют в зону над внешним магнитом, прикрепляются и распластываются.

    Выводы. Предложенная оригинальная технология культивирования МСК с магнитными частицами является безопасной, может использоваться для субретинального введения в экспериментальной офтальмологии и является основой для разработки методик локального введения МСК с целью фиксации клеточного материала.


Страница источника: 431
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru