Online трансляция


Всероссийская научно-практическая конференция
Новые технологии в офтальмологии
Новые технологии в офтальмологии
Казань, 13-14 апреля 2017 г.



Межрегиональный круглый стол
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Лечение синдрома «сухого глаза»: от поликлиники до высоких технологий
Новосибирск, 19 апреля 2017 года с 12:00 до 14.00 по Московскому времени

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 24 2017
№ 23 2016
№ 22 2016
№ 21 2016
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 1 2017
№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№1 (33) Март 2017
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст

Экспериментальное обоснование эффективности интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в профилактике помутнений задней капсулы хрусталика


1----------

    На правах рукописи

    ФЕДОТОВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА

    Экспериментальное обоснование эффективности интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в профилактике помутнений задней капсулы хрусталика

    14.01.07. — глазные болезни

    (медицинские науки)

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата

    медицинских наук

    Москва — 2010

    

    Работа выполнена в Калужском филиале Федерального государственного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

    Научный руководитель

    доктор медицинский наук, профессор Белый Юрий Александрович

    Официальные оппоненты:

    доктор медицинских наук Борзенок Сергей Анатольевич

    доктор медицинских наук Анисимова Светлана Юрьевна

    Ведущая организация Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт глазных болезней РАМН

    Защита состоится «___» ___________2010 года в _____ часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук Д.208.014.01 при Федеральном государственном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59А)

    С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

    Автореферат разослан « ___» ____________ 2010 г.

    Ученый секретарь доктор медицинских наук диссертационного совета Агафонова В.В.

    

    ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

    Актуальность проблемы. Профилактика помутнений задней капсулы хрусталика, получивших название фиброза или вторичной катаракты, до сих пор сохраняет свою актуальность и значимость в офтальмологии. Согласно статистическим исследованиям, особенно часто помутнение задней капсулы хрусталика (ПЗК) диагностируется у пациентов старшей возрастной группы (до 50%), детей (до 93,2%), а также у больных с системными, синдромными заболеваниями и сопутствующей глазной патологией (до 70,7%) (Егорова Э.В., 2003; Зубарева Л.Н., 1993; Nishi O., 2003).

    На сегодняшний день основной причиной развития этого специфического осложнения катарактальной хирургии принято считать послеоперационную пролиферацию и распространение по поверхности задней капсулы хрусталика сохранившегося субкапсулярного эпителия, так как очевидно, что даже при самой тщательной механической очистке капсульной сумки в ходе операции никогда не удается полностью удалить хрусталиковые массы (Касимова Д.П., 2004; Disk B., 1996; Spalton D.J., 1999). Кроме того, немаловажным предрасполагающим фактором является особенность анатомического расположения герминативной зоны, делающей невозможной визуальный контроль полной эвакуации клеточных элементов во время отмывания хрусталиковых масс (Богословский А.И., 1962).

    В настоящее время на решение проблемы профилактики ПЗК хрусталика направлен целый ряд мероприятий. В литературе обсуждается значение методик вскрытия передней капсулы, необходимость тщательного выполнения каждого узлового этапа операции, роль дизайна и материала интраокулярной линзы (ИОЛ), целесообразность имплантации интракапсулярных колец и т.д. (Зуев В.К., 1999; Егорова Э.В., 2002; Иошин И.Э., 2004; Brinci H., 1995; Hara T., 1996). Кроме того, анализируются различные фармакологические способы профилактики ПЗК, включающие применение лидокаина, гепарина, протеолитических ферментов, цитостатиков, ингибиторов факторов роста и др. (Двали М.Л., 1998; Behar-Cohen F.F., 1995; Mastopasqua L., 1997; Nagamoto T., 1997, Nishi O., 1998).

    В этой связи следует отметить, что в последние годы наблюдается возрастающий интерес к фотодинамической терапии (ФДТ), широко применяющейся для лечения опухолевых заболеваний различных локализаций, а также ряда заболеваний неопухолевой природы (Копаева В.Г., 1993; Андреев Ю.В., 1993; Миронов А.Ф., 1996; Каплан М.А., 1998; Будзинская М.В., 2004; Jori G., 1996).

    Помимо применения ФДТ в офтальмоонкологии и лечении неоваскулярных мембран различной этиологии (Аветисов С.Э., Лихванцева В.Г., 2003; Белый Ю.А., 2004; Тахчиди Х.П., 2008; Arroyo J.G., 2003), в отдельных публикациях приводятся положительные результаты экспериментальных исследований по использованию ФДТ для профилактики ПЗК. Как правило, они касаются изучения влияния различных фотосенсибилизаторов (ФС) на клеточные культуры хрусталика in vitro, и лишь единичные исследования посвящены оценке антипролиферативного эффекта водных растворов некоторых ФС на глазах экспериментальных животных (Koh H.J., 2002; Van Tenten Y., 2002; Melendez R.F., 2005).

    По мнению многих исследователей, наиболее перспективными для ФДТ различной офтальмопатологии следует считать ФС хлоринового ряда (Пономарев Г.В., Решетников А.В., 1999; Лощенов В.Б., 2003; Белый Ю.А., 2007). Среди отечественных ФС хлоринового ряда следует выделить «Фотодитазин», «Радахлорин», «Фотолон». При этом в «Фотодитазине» имеется существенно меньшее (не более 3,5%) сопутствующих примесей по сравнению с аналогами, что обуславливает его большую эффективность (Каплан М.А., 2004; Решетников А.В., 2005; Белый Ю.А., 2008).

    Интерес к возможности использования ФДТ в профилактике послеоперационных ПЗК хрусталика, нерешенность на сегодняшний день целого комплекса вопросов, касающихся доз ФС и лазерного излучения, влияния ФС на ткани глаза, оптимального способа доставки ФС к капсуле хрусталика и послужили основанием к проведению настоящих исследований.

    Цель исследования — разработать и обосновать в эксперименте методику интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика.

    В соответствии с поставленной целью задачи решались в следующей последовательности:

    1. Создать экспериментальную модель пролиферирующих клеток хрусталика, участвующих в развитии помутнения его задней капсулы.

    2. В экспериментах in vitro определить оптимальную концентрацию и экспозицию «Фотодитазина», а также дозу лазерного излучения для проведения фотодинамической терапии.

    3. С помощью методов математического моделирования оптимизировать параметры дозы лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин».

    4. Разработать способ доставки рассеянного лазерного излучения к капсуле хрусталика в ходе интраоперационной фотодинамической терапии.

    5. В экспериментах in vivo разработать методику проведения интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в ходе факоэмульсификации и оценить реакцию герминативной зоны хрусталика на применение разработанной методики.

    Научная новизна

    1. Cоздана экспериментальная модель пролиферирующих клеток хрусталика, которая состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток, участвующих в развитии помутнения задней капсулы. Данная модель пригодна для выполнения последующих скрининговых исследований по профилактике помутнения задней капсулы хрусталика в условиях in vitro.

    2. На созданной культуре пролиферирующих клеток хрусталика in vitro определены оптимальные параметры фотодинамической терапии с препаратом «Фотодитазин»: экспозиция фотосенсибилизатора 1 минута, концентрация 0,01 мг/мл, доза лазерного излучения 5 Дж/см².

    3. На основании математического моделирования оптимизированы параметры лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии.

    4. Разработан способ доставки рассеянного лазерного излучения для проведения интраоперационной фотодинамической терапии посредством изогнутого световода, позволяющего равномерно распределять лазерное излучение во все направления и свободно манипулировать в передней камере глаза, не прибегая к дополнительным разрезам во время операции.

    5. В экспериментах in vivo на основе клинико-функциональных и морфологических исследований доказана высокая эффективность интраоперационной фотодинамической терапии для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика.

    Практическая значимость

    Проведенный комплекс экспериментальных исследований позволил разработать новый безопасный интраоперационный интракапсулярный способ профилактики послеоперационных помутнений задней капсулы хрусталика, использование которого в клинической практике катарактальной хирургии позволит значительно снизить риск развития данного осложнения, благодаря выраженному фотодинамическому эффекту воздействия, обладающего высокой антипролиферативной активностью.

    Основные положения, выносимые на защиту

    Разработанная методика интраоперационной фотодинамической терапии в ходе ультразвуковой факоэмульсификации является высокоэффективным и безопасным для тканей глаза энергетическим воздействием, обладающим выраженным фотодинамическим эффектом с высокой антипролиферативной активностью.

    Использование интраоперационной фотодинамической терапии с «Фотодитазином» в ходе ультразвуковой факоэмульсификации позволяет значительно снизить риск развития послеоперационных помутнений задней капсулы хрусталика.

    Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции офтальмологов Причерноморья (Анапа, 2006 г.), клинической конференции ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» (Москва, 2006 г.), II Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007 г.), Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза» (Оренбург, 2007 г.), республиканской конференции «Новые технологии в офтальмологии» (Казань, 2008 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2008» (Москва, 2008 г.).

    Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 4 — в центральной печати. Получены патент РФ на изобретение, патент РФ на полезную модель.

    Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 43 рисунками, содержит 6 таблиц. Указатель литературы включает 166 источников, из них 61 отечественный и 105 зарубежных.

    Работа выполнена в Калужском филиале ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии» (директор — к.м.н., заслуженный врач РФ А.В. Терещенко). Экспериментальные исследования на культуре эпителиальных клеток хрусталика in vitro проведены на базе НИИ трансплантологии и искусственных органов РАМН (г. Москва) в лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. лабораторией, д.м.н., проф. Н.А. Онищенко) при участии старшего научного сотрудника, к.б.н. М.Е. Крашенинникова и врача-иммунолога, д.м.н. А.А. Темнова. Морфологические исследования выполнены в ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» на базе патогистологической лаборатории под руководством к.м.н. А.В. Шацких.

    

    СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

    Отработка параметров фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» на культуре пролиферирующих клеток хрусталика

    (Экспериментальные исследования in vitro)

    Экспериментальные исследования in vitro, являясь первым этапом в комплексе экспериментальных исследований настоящей диссертационной работы, включали:

    - разработку методики получения культуры пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика и обоснование ее пригодности в качестве скрининговой модели для выполнения последующих исследований в условиях in vitro;

    - оценку степени выраженности фотодинамического эффекта на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика;

     — определение оптимальных экспозиции и концентрации ФС «Фотодитазин», а также дозы лазерного излучения (ЛИ) на культуру пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика для выбора адекватных параметров ФДТ в профилактике ПЗК.

    Материалы и методы. Для создания клеточной культуры хрусталика использованы 4-х энуклеированных глаза двух кроликов породы Шиншилла.

    Выделение тканей проводилось под визуальным контролем налобных линз с 4-х кратным увеличением с использованием микрохирургического инструментария. Для культивирования клеток применялась ростовая среда DMEM/Ham’s F-12 («Sigma», США) и СО2 инкубатор IGO 150 («Joan», Франция). Пересевание и морфологическое исследование органной культуры хрусталика проводились под контролем светового микроскопа ТЕ-100 («Nikon», Япония), оснащенного фильтрами для исследования флюоресценции в различных областях спектра излучения. Для фотографирования использовали цифровую фотокамеру «Axiocam color» («Karl Zeiss Yena», Германия). Изучение митохондриального дыхания анализируемых клеток выполнялось по методике Мосмана и Монкса. Значения оптической плотности снимали при помощи планшетного анализатора иммуноферментных реакций «Униплан» АИРФ-01 (ЗАО «Пикон», Россия). Полученные данные служили показателем активности митохондриального дыхания клеток, исходя из того, что, чем больше образуется кристаллов, тем больше увеличивается оптическая плотность. Это позволило судить о количестве живых клеток. Так, в случае, если клетки не проявляли никакой жизненной активности, осадок не выпадал, и, соответственно, оптическая плотность, в сравнении с исходной, не изменялась.

    Цитофототоксический эффект «Фотодитазина» исследовали по продукции активных форм кислорода эпителиальными клетками хрусталика методом хемилюминесценции с помощью хемилюминометра («LKB-2», Швеция). Запись кривых хемилюминесцентной реакции проводили в течение 15 минут при температуре 37°С. В качестве усилителя свечения использовали люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) («Sigma», США) в конечной концентрации 10-3М, а в качестве активатора образования активных форм кислорода применяли РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) («Sigma», США) в концентрации 10-5М. Жизнеспособность клеток в культуре изучали на проточном цитофлюориметре «FC 500» (BC Cytomics, США).

    Облучение культуры клеток проводили диодным лазером «АЛОД-01» («АЛКОМ-Медика», Санкт-Петербург) с длиной волны 662±2 нм, которая соответствует пику поглощения ФС «Фотодитазин». Мощность ЛИ на выходе световода измеряли на приборе ИИМ-1П (ООО «Полироник», Россия).

    Экспозицию лазерного ЛИ рассчитывали по формуле:

    

    Экспериментальная модель пролиферирующей клеточной культуры хрусталика. Из энуклеированных глаз кролика интракапсулярно выделяли хрусталик, затем со стороны заднего полюса разделяли его на четыре части. После этого механически освобождали капсулу хрусталика с прилежащими кортикальными массами от ядра, измельчали до мелких кусочков размером 1 мм3 с последующей обработкой 0,05% р-ром коллагеназы первого типа и 0,25% р-ром трипсина. Далее культуру клеток отмывали трехкратным центрифугированием в течение 5 минут при температуре 4°С и 1500 об/мин, разводя осадок клеток в бессывороточной среде DMEM/Ham?s F-12. Полученную культуру высевали в культуральные чашки в концентрации 5?105 клеток на см3 и выращивали при температуре 37°С, 5% СО2, 95% влажности в СО2 инкубаторе. В качестве ростовой среды использовали DMEM/Ham's F-12 с содержанием 20% фетальной сыворотки коров HyClone, 20 нг/мл эпидермального фактора роста, 0,4 мкм инсулина, 10 нм дексаметазона и 50 мкг/мл гентамицина. Среду меняли каждые 4 дня.

    В результате через 6 недель была получена пролиферирующая клеточная культура хрусталика, занимающая 75% монослоя. Морфология клеток соответствовала эпителиальному типу с видимым присутствием фибробластных клеток. При этом отмечалось, что эпителиальные клетки количественно преобладали над фибробластными. При последующих пересевах, необходимых для получения достаточного количества клеток для проведения опытов, происходила постепенная элиминация эпителиальных клеток с замещением их на фибробластные, что явилось основанием в дальнейших экспериментальных исследованиях использовать смешанную культуру только после второго пересева.

    Для подтверждения предварительных морфологических данных проводили специфическое окрашивание моноклональными антителами. Так, при окрашивании моноклональными антителами на цитокератины 18 и 19 было подтверждено наличие в культуре эпителиальных клеток. Окрашивание моноклональными антителами на виментин зафиксировало наличие в культуре фибробластных клеток.

    Воспроизводимость результатов получения культуры клеток хрусталика, содержащих преимущественно эпителиальные клетки, позволила прийти к заключению о пригодности разработанной нами методики для создания экспериментальной модели пролиферирующих клеток хрусталика (т. е. модели образования ПЗК), и использовать ее для последующих скрининговых исследований, направленных на профилактику ПЗК хрусталика в условиях in vitro, в частности, с применением ФДТ.

    Влияние различных концентраций фотосенсибилизатора «Фотодитазин» и доз лазерного излучения на жизнеспособность культуры клеток хрусталика. Исследовались различные концентрации водного раствора «Фотодитазина»: 0,005, 0,01, 0,05 и 0,1 мг/мл — и дозы лазерного излучения: 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 Дж/см². Взятые параметры ФДТ соответствовали средним значениям, используемым в ранее проведенных аналогичных экспериментальных исследованиях (Koh H.J., 2002; Van Tenten Y., 2002; Melendez R.F., 2005).

    Мощность ЛИ (с длиной волны 662±2 нм) на выходе световода с диффузором на конце составляла 150 мВт. В проведенных ранее исследованиях по воздействию рассеянного лазерного излучения на структуры глаза (Белый Ю.А. с соавт., 2005) было установлено, что мощность ЛИ 150 мВт не оказывает повреждающего воздействия на ткани глаза.

    Для проведения исследований клетки были распределены в лунки 96-луночного культурального планшета в шахматном порядке через 1 лунку в концентрации 7?10? клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды. Затем культуру пролиферирующих клеток хрусталика делили на группы: опытную, контроль 1, контроль 2 и контроль 3.

    В контроле 1 выполняли изолированное лазерное облучение пролиферирующих клеток хрусталика в вышеуказанных дозах. Контролем 2 служила культура клеток хрусталика с изолированным воздействием на нее растворами ФС «Фотодитазин» в вышеуказанных концентрациях. Контролем 3 служила интактная культура клеток, не подвергавшаяся никакому воздействию.

    В лунки опытной группы вносили 100 мкл раствора «Фотодитазина» в различных концентрациях, инкубировали в темноте в течение 10 минут при температуре 37?С, 5% СО2 и 95%-ной влажности в СО2 инкубаторе. Облучение культуры клеток проводили с помощью специально разработанного световода с диффузором на конце через отверстие O 6 мм (площадью — 0,28 см2) в черном светонепроницаемом трафарете, соответствующем диаметру лунки. Для получения выбранного диапазона доз (от 1 до 50 Дж/см2), зная мощность и площадь облучения, в каждом случае рассчитывали необходимую экспозицию ЛИ (таблица).

    В результате проведенных исследований было установлено, что в опытной группе при различных сочетаниях используемых концентраций «Фотодитазина» и доз ЛИ наблюдался фотодинамический эффект, выражавшийся в отсутствии митохондриального дыхания клеток. Обращал на себя внимание и тот факт, что цитофототоксический эффект в диапазоне концентраций ФС от 0,01 до 0,1 мг/мл и параметров ЛИ от 5 до 50 Дж/см2 был одинаковым и максимально выраженным.

    При проведении МТТ-теста в опытных группах отмечалось отсутствие митохондриального дыхания. Микроскопически все клетки оставались неизмененными, и митотическое деление в них отсутствовало.

    Количественный анализ по исследованию жизнеспособности клеток в опытной группе на проточном цитофлюориметре свидетельствовал о значительном цитотоксическом эффекте фотодинамического воздействия с ФС «Фотодитазин», на что указывала гибель более 95% клеток практически сразу после проведения эксперимента.

    Во всех контрольных группах сохранялись жизнеспособность, пролиферативная активность и митохондриальное дыхание клеток.

    Таким образом, полученные результаты показали, что достижение фотодинамического (цитофототоксического) эффекта возможно при применении минимальной концентрации «Фотодитазина» (0,01 мг/мл) и минимальной дозы ЛИ (5 Дж/см²) при мощности на выходе 150 мВт с экспозицией 9 секунд.

    Определение оптимальной экспозиции фотосенсибилизатора на культуру клеток хрусталика для достижения цитофотоксического эффекта. Для проведения эксперимента был использован водный раствор «Фотодитазина» в концентрации 0,01 мг/мл (минимальная концентрация) и ЛИ в дозе 5 Дж/см2 (оптимальная доза). Фотодинамическая активность исследовалась в культуре клеток хрусталика, как в растворе ФС, так и после отмывания от ФС через 1, 5, 10, 20, 30 минут их инкубирования в темноте.

    Цитофототоксический эффект «Фотодитазина» оценивали методом хемилюминесценции по продукции активных форм кислорода эпителиальными клетками хрусталика.

    В результате исследований было установлено, что после фотодинамического воздействия продукция активных форм кислорода эпителиальными клетками резко снижалась, что указывало на реализацию в культуре клеток цитофототоксического эффекта, который был одинаково выражен как при экспозиции ФС в течение 1 минуты, так и в течение 30 минут. Данное обстоятельство позволило прийти к заключению, что экспозиции ФС в течение 1 минуты достаточно для достижения фотодинамического эффекта.

    Таким образом, в результате проведенных in vitro исследований были определены оптимальные параметры фотодинамического воздействия: концентрация «Фотодитазина» — 0,01 мг/мл, экспозиция — 1 минута, доза ЛИ — 5 Дж/см2 при мощности на выходе 150 мВт в течение 9 секунд.

    Использование данного режима фотодинамического воздействия in vitro на культуре пролиферирующих клеток хрусталика дает значительный цитофототоксический эффект, подтверждаемый гибелью более 95% культивированных клеток. Отсутствие при этом лизиса погибших клеток снижает вероятность развития активного воспаления в глазу, стимулирующего пролиферацию и образование ПЗК хрусталика.

    В связи с тем, что распространение ЛИ в объеме капсульного мешка хрусталика отличается от проецируемого на поверхность, и раствор «Фотодитазина» снижает интенсивность флюоресценции за счет ее поглощения молекулами ФС, возникла необходимость проведения дополнительных расчетов параметров объемной дозы ЛИ, эквивалентной поверхностному облучению.

    Оптимизация параметров лазерного излучения для интраоперационной фотодинамической терапии с фотосенсибилизатором «Фотодитазин»

    Расчет объемной дозы лазерного излучения с учетом параметров хрусталика. Для вычисления объемной дозы, эквивалентной таковой при поверхностном фотодинамическом воздействии, сначала рассчитывали объем хрусталика по следующей формуле:

    Вычисление коэффициента поглощения лазерного излучения. Для расчета коэффициента лазерного поглощения α были проведены теоретические исследования, для чего была измерена мощность ЛИ, расположенного в различных средах. Опыт проводили следующим образом: первоначально измеряли мощность ЛИ на конце световода с использованием интегрального измерителя мощности «ИММ-1П» (ООО «Полироник», Москва), отражающего мощность ЛИ на выходе. Затем измеряли мощность ЛИ на выходе из световода, помещенного в пустую пробирку, на третьем этапе — в пробирку с фотосенсибилизирующим гелем, содержащим 0,01 мг/мл «Фотодитазина».

    В качестве источника излучения использовался диодный лазер АЛОД-01 фирмы «Алком-Медика» (Санкт-Петербург) с длиной волны 662 нм. Лазерное излучение подводилось при помощи гибкого световода d=0,6 мм с диффузором на конце. Мощность ЛИ изменялась в диапазоне 0,03-0,9 Вт, что соответствовало минимальному и максимальному значениям прибора.

    Коэффициент поглощения для фотосенсибилизирующего геля вычисляли по отношению разности пропускания ЛИ в различных средах: воздухе, пустой пробирке и пробирке, наполненной гелем. За исходное значение брали мощность ЛИ на выходе световода (среда — воздух). Затем вычисляли разницу значений мощности световодов, помещенных в пустую пробирку (среда — пробирка), и пробирку, содержащую фотосенсибилизирующий гель (среда — ФС гель). Таким образом, получали значение мощности, соответствующее мощности при прохождении ЛИ через гель. Причем для расчета коэффициента поглощения α брали средние значения мощности, при которых отмечалась прямая корреляция:

    

    В ходе вычислений было получено, что коэффициент поглощения α для фотосенсибилизирующего геля «Фотодитазин» составляет 0,31.

    Определение экспозиции лазерного излучения. Расчет экспозиции ЛИ (t, сек), необходимой для получения объемной дозы ЛИ 0,53 Дж/см3, которая достаточна для достижения цитотоксического эффекта «Фотодитазина» на герминативную зону хрусталика, проводили, используя полученные данные объема хрусталика (2,55 см3), коэффициента поглощения α (0,31) и значение мощности ЛИ на конце световода с диффузором 150 мВт.

    

     Таким образом, нами было получено значение экспозиции ЛИ — 13 сек, необходимое для достижения максимального фотодинамического эффекта на герминативную зону хрусталика при проведении интраоперационной ФДТ, которое и использовалось в дальнейших экспериментальных исследованиях in vivo.

    Оценка эффективности интраоперационной фотодинамической терапии с «Фотодитазином» для профилактики помутнения задней капсулы

    (Экспериментальные исследования in vivo)

    Экспериментальные исследования in vivo, направленные на реализацию цели настоящей диссертационной работы, включали:

    - разработку методики интраоперационной ФДТ с ФС «Фотодитазин» в ходе факоэмульсификации;

    - изучение состояния задней капсулы хрусталика и окружающих его тканей глаза после проведения интраоперационной ФДТ с ФС «Фотодитазин».

    Материалы и методы. Реализация вышеуказанных задач проводилась на 60 глазах 30 кроликов породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, в возрасте 3-х месяцев, с прозрачными хрусталиками и светлыми радужками.

    Для оценки in vivo эффективности ФДТ с ФС «Фотодитазин» все глаза подопытных животных были разделены на четыре группы: две опытные и две контрольные. Первую опытную группу составили 15 глаз, на которых была проведена факоэмульсификация (ФЭ) прозрачного хрусталика в сочетании с интраоперационной ФДТ без имплантации ИОЛ. Вторую опытную группу составили 15 глаз, на которых была проведена ФЭ прозрачного хрусталика в сочетании с интраоперационной ФДТ, и имплантирована ИОЛ (РСП-2) (ООО «НЭП», Россия). Для всех опытных глаз контролем служили соответственно парные афакичные (контроль 1) и артифакичные (контроль 2) глаза животных, на которых ФДТ не проводилась.

    ФЭ прозрачного хрусталика кролика проводили через склеророговичный доступ с использованием техники «борозды» на факоэмульсификаторе «Legacy-2000» («Alcon», США). Параметры ФЭ составили: ультразвук — 20%, вакуум — 400 мм рт. ст., поток ирригационной жидкости — 60 см3/мин. После удаления кортикальных масс на всех глазах опытных групп проводили интраоперационную ФДТ (опыт 1, опыт 2) по предложенной методике. Для этого сначала внутрь капсульного мешка вводили фотосенсибилизирующий гель, содержащий «Фотодитазин» в концентрации 0,01 мг/мл, на основе вискоэластика Визитон-ПЭГ (ООО «НЭП», Россия) в объеме примерно 0,3-0,4 мл. Затем в капсульный мешок и переднюю камеру вводили «DisСoVisс» («Alcon», США) для восполнения их объема и защиты окружающих тканей. После этого через парацентез в капсульный мешок вводили световод с диффузором на конце, располагая его центрально по отношению к зрачку, и проводили лазерное облучение с оптимальными параметрами, определенными на предыдущих этапах исследования. После интракапсулярной ФДТ сначала аспирировали содержимое капсульного мешка, затем — вискоэластик из передней камеры.

    Во 2-й опытной и контрольной группах выбор модели ИОЛ РСП-2 был обусловлен размерами гаптической части (12 мм), которые соответствуют размеру хрусталика глаза кролика и позволяют максимально полно расположить ее внутри капсульного мешка. При этом ни материал ИОЛ, ни ее строение не препятствуют миграции сохранившегося эпителия хрусталика.

    Послеоперационное обследование включало биомикроскопию с фоторегистрацией, офтальмоскопию, ЭРГ и световую микроскопию. Сроки наблюдения составили 1, 7, 14 суток, 1 и 3 месяца после операции.

    Результаты офтальмологического исследования. В первые сутки на всех 30-х опытных и 30-х контрольных глазах клиническая картина была схожей. В 1-й и 2-й опытных группах отмечались инъекция глазного яблока, преимущественно в зоне операционного разреза; незначительный отек роговицы в области тоннеля; в 3-х случаях в 1-й опытной группе и в 4-х случаях во 2-й опытной группе в передней камере был отмечен слабый феномен Тиндаля. В 7 случаях в обеих опытных группах имело место выпадение нитей фибринозного экссудата в области зрачка. Во 2-й опытной группе ИОЛ в капсульном мешке была центрирована.

    В 1-й контрольной группе в 2-х случаях был выявлен феномен Тиндаля I степени, в 4-х случаях — выпадение экссудата. Во 2-й контрольной — в 3-х случаях отмечался феномен Тиндаля I-II степени, в 5 случаях — экссудативная реакция. Задняя капсула хрусталика визуализировалась в виде гладкой и прозрачной пленки. Рефлекс оставался розовым, лишь в 5 случаях был слегка снижен из-за экссудата. В обеих опытных и контрольных группах диск зрительного нерва был не изменен, сосуды соразмерны.

     Послеоперационный период протекал гладко, в обеих опытных и контрольных группах на 7-е сутки глаза были практически спокойными. Фибринозный экссудат полностью рассасывался, прозрачность передней камеры восстанавливалась. Во 2-й опытной группе положение ИОЛ в капсульном мешке было стабильным.

    Задняя капсула в обеих опытных группах оставалась натянутой в виде прозрачной пленки. В 1-й и во 2-й контрольных группах, в 7 и 4-х случаях, соответственно, наблюдалась ее легкая складчатость с клеточными элементами, напоминающие жемчужины.

    На 14 день все глаза выглядели спокойными. В 1-й опытной группе в 1 случае появилась незначительная складчатость задней капсулы ввиду ее провисания. Во 2-й опытной группе ИОЛ располагалась в капсульном мешке центрально, задняя капсула была натянута в виде прозрачной пленки. В 1-й контрольной группе во всех глазах (9 глаз) увеличилась складчатость задней капсулы, в 3-х случаях выявлялись единичные клетки Адамюка-Эльшнига. Во 2-й контрольной группе в 8 случаях выявлялась складчатость задней капсулы, в 1 случае — вторичная катаракта.

    Через 1 месяц ни в одной из исследуемых групп воспалительного процесса выявлено не было. В 1-й опытной группе в 3-х случаях отмечалась незначительная складчатость задней капсулы, в 1 случае  — легкий фиброз на периферии капсульного мешка. Во 2-й опытной группе во всех случаях задняя капсула была прозрачной и натянутой, клеточные элементы отсутствовали. В 1-й контрольной группе на всех глазах отмечался фиброз I степени, при этом в половине случаев обнаруживалось неравномерное разрастание хрусталиковых волокон по периферии и в центре, ухудшавшее рефлекс глазного дна. Во 2-й контрольной группе фиброз I степени отмечался в 4-х случаях, в 2-х случаях — образование ПЗК.

    Через 3 месяца основные изменения происходили с задней капсулой хрусталика. В 1-й опытной группе выявлялась незначительная складчатость задней капсулы, в 1 случае — легкий фиброз капсульного мешка. Во 2-й опытной группе задняя капсула была свободна от клеточных элементов, ИОЛ была центрирована в капсульном мешке.

    В 1-й контрольной группе обнаруживались выраженные разрастания хрусталикового эпителия в виде кольца Зоммеринга, в 2-х случаях — разрастания шаров Адамюка-Эльшнига в центральной зоне, в 2-х случаях определялся фиброз задней капсулы. Во 2-й контрольной группе также в 2-х случаях выявляли выраженные разрастания хрусталикового эпителия в виде кольца Зоммеринга, в 1 случае — фиброзные изменения задней капсулы и неравномерные разрастания шаров Адамюка-Эльшнига в центральной зоне.

    Таким образом, послеоперационная клиническая картина и в опытных, и в контрольных группах отражала воспалительную реакцию на операционную травму. С увеличением периода наблюдения на контрольных глазах отмечалось образование ПЗК, преимущественно за счет разрастания эпителиальных клеток хрусталика. Что касается опытных глаз, то в них определялось отсутствие каких-либо признаков ПЗК хрусталика, что указывало на стабильный антипролиферативный эффект ФДТ.

    Динамический контроль не выявил значимых отклонений внутриглазного давления от нормы во всех исследуемых группах, что свидетельствовало об отсутствии влияния интраоперационной ФДТ на гидродинамику глаза.

    Полученные изменения показателей ЭРГ как в опытных, так и в контрольных группах свидетельствовали о наличии незначительной реакции на оперативное вмешательство и об отсутствии ретинальной токсичности интраоперационной ФДТ с используемыми параметрами.

    Результаты световой микроскопии. В 1-е сутки на всех глазах опытных групп в месте операционного разреза отмечалась клеточная инфильтрация, роговица была неизменена, цилиарное тело, стекловидное тело и сетчатка — без изменений. В 1-й опытной группе задняя капсула представляла собой бесклеточную мембрану с шероховатой поверхностью. Во 2-й опытной группе между листками передней и задней капсул диагностировался диастаз, заполненный ИОЛ в сочетании с незначительными остатками хрусталиковых волокон в области экватора хрусталика. В обеих контрольных группах особых отличий от опытных групп не наблюдалось.

    На 7-е сутки в 1-й опытной группе наблюдалось сохранение структуры клеточных элементов в дубликатуре капсулы, явления пролиферации и фибротизации отсутствовали. Во 2-й опытной группе клетки передней капсулы хрусталика и ростковой зоны в области экватора были интактны, без явлений пролиферации. Радужка и цилиарное тело оставались неизмененными.

    В контрольных группах в области сохраненного участка хрусталиковых волокон выявлялись начальные явления пролиферации, как в 1-й контрольной группе, так и во 2-й (при наличии ИОЛ в капсульном мешке). Со стороны других структур глаза изменений выявлено не было.

    На 14-е сутки как в 1-й, так и во 2-ой опытной группе задняя капсула на всем протяжении сохраняла свою структуру без явлений фибротизации и пролиферации в герминативной зоне.

    В 1-й контрольной группе в 2-х случаях местами выявлялась выраженная складчатость задней капсулы хрусталика, а также усилившиеся явления фибротизации в области переднего капсулорексиса, в результате чего в процесс вовлекалась задняя поверхность радужки.

    Во 2-й контрольной группе отмечалось разрастание фиброзной ткани по внутренней поверхности капсульного мешка, практически с одинаковым распространением вдоль передней и задней капсул от герминативной зоны. Выявлялось разрастание нежных волокнистых структур на поверхности передней капсулы.

    Через 1-3 месяца в обеих опытных группах динамика фибротизации задней капсулы практически отсутствовала: эпителиальные клетки в дубликатуре капсулы оставались неизмененными, что подтверждало положительный цитостатический эффект ФДТ.

    Во всех контрольных группах отмечалось усугубление процесса фибротизации задней капсулы: в дубликатуре между листками передней и задней капсул обнаруживалось разрастание фиброзной ткани, отсутствовавшее в опытных группах.

    Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований in vivo свидетельствуют о том, что разработанная методика интраоперационной ФДТ с использованием фотосенсибилизирующего геля «Фотодитазин» оказывает выраженный цитофотостатический эффект на сохранившиеся после операции эпителиальные клетки герминативной зоны хрусталика, что подтверждает ее патогенетическую направленность для профилактики ПЗК хрусталика после экстракапсулярных методов удаления катаракты.

    Выводы

    1. Созданная экспериментальная модель пролиферирующих клеток хрусталика состоит из эпителиальных и фибробластоподобных клеток, участвующих в развитии помутнения задней капсулы, пригодна для выполнения скрининговых исследований по его профилактике в условиях in vitro.

    2. Установленные в эксперименте in vitro на культуре пролиферирующих клеток хрусталика доза фотосенсибилизатора «Фотодитазин» (0,01 мг/мл) и его экспозиция (1 мин) в сочетании с дозой лазерного излучения 5,0 Дж/см² обуславливают выраженный цитофототоксический эффект фотодинамического воздействия, приводящего к гибели 95% клеток культуры.

    3. Учитывая анатомические особенности капсульного мешка хрусталика и специфику внутритканевого распространения лазерного излучения, коэффициент лазерного поглощения α 0,31 для фотосенсибилизирующего геля, содержащего 0,01 мг/мл «Фотодитазина», позволяет более точно рассчитать объемную дозу лазерного излучения — 0,53 Дж/см3 (при мощности на выходе 150 мВт в течение 13 секунд), используемую для проведения интраоперационной фотодинамической терапии.

    4. Разработанный световод является адекватным способом доставки рассеянного лазерного излучения к герминативной зоне хрусталика в ходе интраоперационной фотодинамической терапии и позволяет равномерно распределять лазерное излучение в среде фотосенсибилизирующего геля, а также свободно манипулировать в передней камере глаза, не прибегая к дополнительным операционным разрезам.

    5. Разработанная методика интраоперационной фотодинамической терапии в ходе ультразвуковой факоэмульсификации является высокоэффективным способом профилактики помутнения задней капсулы хрусталика, обладающим выраженным фотодинамическим эффектом с высокой антипролиферативной активностью. Методика проста в выполнении, не сопровождается специфическими осложнениями и не влияет на проведение этапов факоэмульсификации катаракты.

    Список основных статей, опубликованных по теме диссертации

    Публикации:

    1. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В. и др. Изучение влияния фотодинамического воздействия на культуру клеток хрусталика кролика in vitro // Рефракционная хирургия и офтальмология. — 2006. — Т. 6. — № 4. — С. 17-21.

    2. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В. и др. Фотодинамическая терапия культуры клеток хрусталика кролика in vitro // Вестн. Оренбургского государственного университета. — 2006. — № 11. — С. 36-39.

    3. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В., Шацких А.В. Фотодинамические эффекты в профилактике помутнения задней капсулы хрусталика (экспериментальное исследование). // Сибирский консилиум (медико-фармацевтический журнал).– 2007. — № 3. — С. 97-100.

    4. Федотова М.В. Применение фотодинамической терапии с хлорином е6 для профилактики помутнения задней капсулы в эксперименте // Федоровские чтения-2007: Сб. тез. — М., 2007. — С. 258-259.

    5. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В., Шацких А.В. Экспериментальная интракапсулярная фотодинамическая терапия с гелем «Фотодитазин» в профилактике помутнения задней капсулы // Новые технологии в офтальмологии: Сб. ст. — Чебоксары, 2007. — С. 190-194.

    6. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В., Шацких А.В. Возможности местного применения «Фотодитазина» для профилактики помутнения задней капсулы хрусталика в эксперименте // Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии-2007: Сб. науч. ст. — М., 2007. — С. 30-35.

    7. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В., Шацких А.В. Интракапсулярная фотодинамическая терапия в эксперименте // Вестн. Оренбургского государственного университета. — 2007. — № 78. — С. 23-27.

    8. Терещенко А.В., Белый Ю.А., Федотова М.В. и др. Новая технология получения первичной органной культуры хрусталика // Всероссийская научно-практ. конф. с международ. участ. «Федоровские чтения-2008»: Сб. науч. ст.– М., 2008. — С. 330.

    9. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В., Шацких А.В. Профилактика помутнения задней капсулы методом интраоперационной интракапсулярной фотодинамической терапии в эксперименте // Офтальмохирургия. — 2008. — № 2. — С. 41-45.

    10. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В. и др. Метод интракапсулярной фотодинамической терапии в профилактике помутнения задней капсулы в эксперименте // Офтальмология. — 2008. — Т. 5. — № 2. — С. 8-13.

    Патенты:

    1. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Володин П.Л., Фабрикантов О.Л., Федотова М.В. Способ профилактики вторичной катаракты. Патент на изобретение № 2299714, приоритет от 16.11.2005 // Бюл. № 16 от 27.05.2007.

    2. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Федотова М.В. Офтальмологический световод для интракапсулярного облучения. Патент на полезную модель № 82126 по заявке 2008146616 от 27.11.2008 // Бюл. № 11 от 20.04.2009.

    

    Автобиография

    Федотова Марина Владимировна в 2003 году окончила лечебный факультет Смоленской Государственной Медицинской Академии.

    С 2003 г. по 2004 г. прошла интернатуру по офтальмологии на базе Калужского филиала ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии».

    В 2004 году зачислена в штат филиала в качестве врача-офтальмолога хирургического отделения № 2, где работает по настоящее время.

    Автор 32 научных публикаций и 5 патентов РФ на изобретение.

    Замужем, воспитывает дочь.


Страница источника: 0

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru