Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.735-002.156

Японский перепел Coturnix japonica как модель ускоренного старения сетча тки глаза человека. Сообщение 2. Сравнительный анализ содержания ретиноидов в клетках старческого ретинального пигментного эпителия глаза японского перепела и человека


1Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук
2МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ

     Мелкая домашняя птица японский перепел Coturnix japonica рассматривается как удобная лабораторная модель ускоренного старения и дегенеративных заболеваний сетчатки глаза человека [1, 3, 10, 11].

    Средний биологический срок жизни этой птицы находится в пределах полутора лет, и за это время в клетках её ретинального пигментного эпителия (РПЭ) происходит массовое накопление «пигмента старости» — липофусциновых гранул (ЛГ). У человека подобное накопление наблюдается к 60-70 годам [15, 16].

    ЛГ образуются в результате неполной лизосомальной деградации обломков наружных сегментов фоторецепторов, фагоцитированных клетками РПЭ. Они содержат более десятка ретиноидов — производных полностью-транс-ретиналя (ПТР), которые обладают сильной флуоресценцией [9]. ЛГ являются основным источником аутофлуоресценции глазного дна [14].

     Состав ретиноидов в ЛГ может меняться с возрастом, как это было показано при анализе хлороформных экстрактов из ЛГ, выделенных из РПЭ кадаверных глаз человека [5, 6].

    Показано, что ЛГ способны при действии видимого света генерировать активные формы кислорода, т.е. обладают фототоксичностью [4, 8].

    Цель

    В связи с проводимым нами экспериментальным обоснованием возможности использования перепелов C. japonica в качестве модели старения сетчатки в ускоренном временном режиме [2], в настоящей работе проведено сравнение ретиноидного состава ЛГ, полученных из клеток старческого РПЭ перепела и человека.

    Измерения проводились методами регистрации селективной флюоресценции ретиноидов и их фракционирования с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

    Материал и методы

    Использовались кадаверные глаза Глазного тканевого банка ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Перепела C. japonica были получены во ВНИИ птицеводства (г. Сергиев-Посад, МО). В настоящей работе использовались старческие перепела годичного возраста.

    Клетки РПЭ глаз человека слущивали со дна глазного бокала шарошечным шпателем и далее отсасывали в составе глазной жидкости с помощью автоматической пипетки. Собранную жидкость центрифугировали в микропробирках «эппендорф» в объеме 500-700 мкл со скоростью 1000 об/мин. в течение 5 мин.

    Глазные бокалы перепелов, с помощью пинцетов, разделяли на склеру, сетчатку и монослой РПЭ. Полученную ткань РПЭ помещали в микропробирки «эппендорф», гомогенизировали и центрифугировали по вышеуказанной методике.

    В обоих случаях полученный осадок суспендировали в фосфатном буфере и полученный гомогенат использовали для флюориметрических измерений.

    Первоначально были измерены спектры флюоресценции гомогенатов ткани РПЭ.

    На последующем этапе проводили флюориметрические измерения хлороформ-метанольных экстрактов из этой суспензии. Для этого к суспензии добавляли двукратный избыток смеси хлороформ-метанола (2:1), перемешивали на электромагнитной мешалке в течение 2 мин и затем 10 мин инкубировали при температуре 4 С°. Далее смесь центрифугировали на центрифуге MLW K 26 D (680 g, 10 мин., 4 С°). Нижнюю хлороформную фазу отбирали шприцем и использовали для флюориметрического анализа экстрактов ретиноидов.

    После проведения этих измерений хлороформный экстракт высушивали с помощью водоструйного насоса. Оставшееся после упаривания сухое вещество растворяли в 200 мкл метанола и использовали для дальнейшего хроматографического анализа.

    Для определения наиболее эффективных длин волн возбуждения флюоресценции были определены спектры поглощения гомогенатов РПЭ и их хлороформ-метанольных экстрактов.

    Регистрацию спектров поглощения производили на спектрофотометре «Shimadzu UV-1700 PharmaSpecol» (Япония). Спектры флюоресценции регистрировали на флуориметре «Shimadzu RF-5301PC» (Япония).

    Хроматографическое определение производных ретиналя и других полиенов проводили методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия) с использованием колонки «Диасфер 120 С18» (4*250 мм, размер сорбента 5 мкм). Разделение смеси проводили путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% трифторуксусной кислоты) до 100% ацетонитрила за 20 мин; скорость потока 1,5мл/мин. Детектирование компонентов смеси осуществляли по поглощению на длине волны 430 нм с помощью спектрофотометрического детектора «Knauer К-2501».

    Стандарт А2Е (N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламин) приготавливали с помощью методов, описанных в работе [13]. Чистоту стандарта А2Е контролировали методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия).

    Результаты и обсуждение

    1. Сравнение спектров флюоресценции РПЭ перепелов C. japonica и человека.

    Первоначально были проведены сравнительные измерения спектров флюоресценции суспензии клеток РПЭ человека и японского перепела (рис. 1а).

    Из спектров, представленных на этом рисунке, видно, что при возбуждении флюоресценции длиной волны 340 нм в обоих видах РПЭ (левая панель) просматривается два максимума флюоресценции — один около 450 нм и второй около 550 нм, хотя и в разных пропорциях.

    При возбуждении светом с длиной волны 430 нм (рис. 1а, правая панель) в обоих видах РПЭ максимум флюоресценции приходится на полосу 515-530 нм. Сходство в спектрах флюоресценции указывает на сходство состава флуорофоров, содержащихся в РПЭ перепела и человека.

    Рис. 1. Спектры флюоресценции: а) суспензии клеток РПЭ перепела и человека в фосфатном буфере; б) хлороформных экстрактов из суспензии клеток РПЭ человека и перепела. 1 — спектры флюоресценции при возбуждающей длине волны 340 нм; 2 — при возбуждении светом 430 нм. Черные кривые — спектры флюоресценции суспензии клеток РПЭ глаза человека; красный кривые — спектры флюоресценции суспензии клеток РПЭ глаза перепелок

    Результаты сравнение спектров флюоресценции хлороформных экстрактов из суспензии клеток РПЭ человека и перепела представлены на рис. 1б. Как следует из данных, представленных на этом рисунке, положения максимумов спектров флюоресценции хлороформных экстрактов клеток РПЭ перепела и человека достаточно близки.

    2. Хроматографическое сравнение состава ретиноидов в хлороформных экстрактах, полученных из ЛГ клеток РПЭ перепела и человека.

    На рисунке 2 представлены характерные хроматограммы ретиноидов, экстрагированных из суспензии клеток РПЭ глаз человека и перепела, полученные методом ВЭЖХ.

    Рис. 2. Хроматограммы хлороформных экстрактов из ЛГ клеток РПЭ человека (наверху) и перепела (внизу), детектирование осуществлялось по поглощению на длине волны 430 нм

    Как видно, общая картина распределения пиков для РПЭ человека и РПЭ перепела выглядит сходным образом.

    Группы пиков 1-5 — согласно нашим предыдущим данным [5], принадлежит продуктам (фото)окисления и деградации А2Е; пик 6 — принадлежит, по-видимому, окисленной форме А2Е [5, 13]; пики 7 и 9 — являются А2Е и его изомерная форма изо-А2Е соответственно [13].

    Группа пиков 12 предположительно содержит такие производные полностью-транс-ретиналя (ПТР), как А2-дигидропиридин-фосфатидилэтаноламин (A2-DHP-PE) и А2-дигидропиридин-этаноламин (A2-DHP-E) [17], а также ПТР-димер, полностью-транс-ретиналь димер этаноламин коньюгат (ПТР-димер-E) и полностью-транс-ретиналь димер фосфатидилэтаноламин коньюгат (ПТР-димер-PE) [12].

    Следует отметить, что присутствие А2Е в составе хлороформного экстракта из клеток РПЭ перепела было обнаружено также в работе [7].

    Из хроматограмм, представленных на рис. 2, видно, что в составе ретиноидов, содержащихся в хлороформном экстракте из РПЭ перепела и человека, находятся общие компоненты, имеющие одинаковые времена удерживания. Речь идёт о группе пиков с временами удерживания 3-5 минут (пики 1-2), пике 5, oxy-А2Е, А2Е и изо-А2Е, а также группе пиков 12. Количественная обработка этих хроматограмм приведена в табл.

    Следует при этом отметить, что у человека относительное количество веществ группы пиков 12, по отношению к А2Е, составляет 0,67, в то время как у перепела относительный вклад группы пиков 12 почти втрое (3,13) больше, чем А2Е (табл.). Напомним, что группу пиков 12 входят, вероятно, такие производные полностью-транс-ретиналя, как A2-DHP-PE и A2-DHP-E [17], а также ПТР-димер, ПТР-димер-E и ПТР-димер-PE [12].

    Из анализа полученных данных видно, что относительное содержание А2Е у человека в 2,3 раза больше, чем у перепела, в то время как относительное количество изомеров А2Е в хлороформных экстрактах из клеток РПЭ глаз человека и перепела вполне сопоставимо (табл.).

    Заключение

    Таким образом, сходство спектральных характеристик и состава ретиноидов в ЛГ, полученных из клеток старческого ретинального пигментного эпителия глаза перепела и человека, позволяет рассматривать японского перепела Coturnix japonica как удобную и достаточно адекватную модель ускоренного старения сетчатки глаза человека, а также как модель для скрининга различных препаратов, регулирующих на процессы старения и развития дегенеративных заболеваний сетчатки.

    

    Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Программа Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».


Страница источника: 47

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru