Мелкая домашняя птица японский перепел Coturnix japonica рассматривается как удобная лабораторная модель ускоренного старения и дегенеративных заболеваний сетчатки глаза человека [1, 3, 10, 11].

    Средний биологический срок жизни этой птицы находится в пределах полутора лет, и за это время в клетках её ретинального пигментного эпителия (РПЭ) происходит массовое накопление «пигмента старости» — липофусциновых гранул (ЛГ). У человека подобное накопление наблюдается к 60-70 годам [15, 16].

    ЛГ образуются в результате неполной лизосомальной деградации обломков наружных сегментов фоторецепторов, фагоцитированных клетками РПЭ. Они содержат более десятка ретиноидов — производных полностью-транс-ретиналя (ПТР), которые обладают сильной флуоресценцией [9]. ЛГ являются основным источником аутофлуоресценции глазного дна [14].

     Состав ретиноидов в ЛГ может меняться с возрастом, как это было показано при анализе хлороформных экстрактов из ЛГ, выделенных из РПЭ кадаверных глаз человека [5, 6].

    Показано, что ЛГ способны при действии видимого света генерировать активные формы кислорода, т.е. обладают фототоксичностью [4, 8].

    Цель

    В связи с проводимым нами экспериментальным обоснованием возможности использования перепелов C. japonica в качестве модели старения сетчатки в ускоренном временном режиме [2], в настоящей работе проведено сравнение ретиноидного состава ЛГ, полученных из клеток старческого РПЭ перепела и человека.

    Измерения проводились методами регистрации селективной флюоресценции ретиноидов и их фракционирования с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

    Материал и методы

    Использовались кадаверные глаза Глазного тканевого банка ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Перепела C. japonica были получены во ВНИИ птицеводства (г. Сергиев-Посад, МО). В настоящей работе использовались старческие перепела годичного возраста.

    Клетки РПЭ глаз человека слущивали со дна глазного бокала шарошечным шпателем и далее отсасывали в составе глазной жидкости с помощью автоматической пипетки. Собранную жидкость центрифугировали в микропробирках «эппендорф» в объеме 500-700 мкл со скоростью 1000 об/мин. в течение 5 мин.

    Глазные бокалы перепелов, с помощью пинцетов, разделяли на склеру, сетчатку и монослой РПЭ. Полученную ткань РПЭ помещали в микропробирки «эппендорф», гомогенизировали и центрифугировали по вышеуказанной методике.

    В обоих случаях полученный осадок суспендировали в фосфатном буфере и полученный гомогенат использовали для флюориметрических измерений.

    Первоначально были измерены спектры флюоресценции гомогенатов ткани РПЭ.

    На последующем этапе проводили флюориметрические измерения хлороформ-метанольных экстрактов из этой суспензии. Для этого к суспензии добавляли двукратный избыток смеси хлороформ-метанола (2:1), перемешивали на электромагнитной мешалке в течение 2 мин и затем 10 мин инкубировали при температуре 4 С°. Далее смесь центрифугировали на центрифуге MLW K 26 D (680 g, 10 мин., 4 С°). Нижнюю хлороформную фазу отбирали шприцем и использовали для флюориметрического анализа экстрактов ретиноидов.

    После проведения этих измерений хлороформный экстракт высушивали с помощью водоструйного насоса. Оставшееся после упаривания сухое вещество растворяли в 200 мкл метанола и использовали для дальнейшего хроматографического анализа.

    Для определения наиболее эффективных длин волн возбуждения флюоресценции были определены спектры поглощения гомогенатов РПЭ и их хлороформ-метанольных экстрактов.

    Регистрацию спектров поглощения производили на спектрофотометре «Shimadzu UV-1700 PharmaSpecol» (Япония). Спектры флюоресценции регистрировали на флуориметре «Shimadzu RF-5301PC» (Япония).

    Хроматографическое определение производных ретиналя и других полиенов проводили методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия) с использованием колонки «Диасфер 120 С18» (4*250 мм, размер сорбента 5 мкм). Разделение смеси проводили путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% трифторуксусной кислоты) до 100% ацетонитрила за 20 мин; скорость потока 1,5мл/мин. Детектирование компонентов смеси осуществляли по поглощению на длине волны 430 нм с помощью спектрофотометрического детектора «Knauer К-2501».

    Стандарт А2Е (N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламин) приготавливали с помощью методов, описанных в работе [13]. Чистоту стандарта А2Е контролировали методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия).

    Результаты и обсуждение

    1. Сравнение спектров флюоресценции РПЭ перепелов C. japonica и человека.

    Первоначально были проведены сравнительные измерения спектров флюоресценции суспензии клеток РПЭ человека и японского перепела (рис. 1а).

    Из спектров, представленных на этом рисунке, видно, что при возбуждении флюоресценции длиной волны 340 нм в обоих видах РПЭ (левая панель) просматривается два максимума флюоресценции — один около 450 нм и второй около 550 нм, хотя и в разных пропорциях.

    При возбуждении светом с длиной волны 430 нм (рис. 1а, правая панель) в обоих видах РПЭ максимум флюоресценции приходится на полосу 515-530 нм. Сходство в спектрах флюоресценции указывает на сходство состава флуорофоров, содержащихся в РПЭ перепела и человека.

    Рис. 1. Спектры флюоресценции: а) суспензии клеток РПЭ перепела и человека в фосфатном буфере; б) хлороформных экстрактов из суспензии клеток РПЭ человека и перепела. 1 — спектры флюоресценции при возбуждающей длине волны 340 нм; 2 — при возбуждении светом 430 нм. Черные кривые — спектры флюоресценции суспензии клеток РПЭ глаза человека; красный кривые — спектры флюоресценции суспензии клеток РПЭ глаза перепелок

    Результаты сравнение спектров флюоресценции хлороформных экстрактов из суспензии клеток РПЭ человека и перепела представлены на рис. 1б. Как следует из данных, представленных на этом рисунке, положения максимумов спектров флюоресценции хлороформных экстрактов клеток РПЭ перепела и человека достаточно близки.

    2. Хроматографическое сравнение состава ретиноидов в хлороформных экстрактах, полученных из ЛГ клеток РПЭ перепела и человека.

    На рисунке 2 представлены характерные хроматограммы ретиноидов, экстрагированных из суспензии клеток РПЭ глаз человека и перепела, полученные методом ВЭЖХ.

    Рис. 2. Хроматограммы хлороформных экстрактов из ЛГ клеток РПЭ человека (наверху) и перепела (внизу), детектирование осуществлялось по поглощению на длине волны 430 нм

    Как видно, общая картина распределения пиков для РПЭ человека и РПЭ перепела выглядит сходным образом.

    Группы пиков 1-5 — согласно нашим предыдущим данным [5], принадлежит продуктам (фото)окисления и деградации А2Е; пик 6 — принадлежит, по-видимому, окисленной форме А2Е [5, 13]; пики 7 и 9 — являются А2Е и его изомерная форма изо-А2Е соответственно [13].

    Группа пиков 12 предположительно содержит такие производные полностью-транс-ретиналя (ПТР), как А2-дигидропиридин-фосфатидилэтаноламин (A2-DHP-PE) и А2-дигидропиридин-этаноламин (A2-DHP-E) [17], а также ПТР-димер, полностью-транс-ретиналь димер этаноламин коньюгат (ПТР-димер-E) и полностью-транс-ретиналь димер фосфатидилэтаноламин коньюгат (ПТР-димер-PE) [12].

    Следует отметить, что присутствие А2Е в составе хлороформного экстракта из клеток РПЭ перепела было обнаружено также в работе [7].

    Из хроматограмм, представленных на рис. 2, видно, что в составе ретиноидов, содержащихся в хлороформном экстракте из РПЭ перепела и человека, находятся общие компоненты, имеющие одинаковые времена удерживания. Речь идёт о группе пиков с временами удерживания 3-5 минут (пики 1-2), пике 5, oxy-А2Е, А2Е и изо-А2Е, а также группе пиков 12. Количественная обработка этих хроматограмм приведена в табл.

    Следует при этом отметить, что у человека относительное количество веществ группы пиков 12, по отношению к А2Е, составляет 0,67, в то время как у перепела относительный вклад группы пиков 12 почти втрое (3,13) больше, чем А2Е (табл.). Напомним, что группу пиков 12 входят, вероятно, такие производные полностью-транс-ретиналя, как A2-DHP-PE и A2-DHP-E [17], а также ПТР-димер, ПТР-димер-E и ПТР-димер-PE [12].

    Из анализа полученных данных видно, что относительное содержание А2Е у человека в 2,3 раза больше, чем у перепела, в то время как относительное количество изомеров А2Е в хлороформных экстрактах из клеток РПЭ глаз человека и перепела вполне сопоставимо (табл.).

    Заключение

    Таким образом, сходство спектральных характеристик и состава ретиноидов в ЛГ, полученных из клеток старческого ретинального пигментного эпителия глаза перепела и человека, позволяет рассматривать японского перепела Coturnix japonica как удобную и достаточно адекватную модель ускоренного старения сетчатки глаза человека, а также как модель для скрининга различных препаратов, регулирующих на процессы старения и развития дегенеративных заболеваний сетчатки.

    

    Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Программа Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».