Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:612.8

Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых грану л ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека в норме и в случае визуализируемой па тологии


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
2Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук

    Неинвазивный метод диагностики глазной патологии — аутофлуоресценция (АФ) глазного дна — позволяет выявлять возрастные изменения и дегенеративные заболевания сетчатки, а также оценивать состояние, сохранность и жизнеспособность комплекса ретинального пигментного эпителия (РПЭ) с сетчаткой [13].
     Основным источником АФ являются липофусциновые гранулы (ЛГ), которые формируются в результате неполной лизосомальной деградации обломков наружных сегментов фоторецепторов, фагоцитированных клетками РПЭ [15]. ЛГ накапливаются в клетках РПЭ как в процессе старения (ЛГ называют также «пигментом старости»), так и при некоторой зрительной патологии. Показано, что ЛГ способны при действии видимого света генерировать активные формы кислорода, т.е. обладают фототоксичностью [2, 3, 9]. Выявлена корреляция между накоплением ЛГ в клетках РПЭ и такими дегенеративными заболеваниями сетчатки, как возрастная макулярная дегенерация, болезнь Штаргардта и ряд других [10, 11, 17, 19].
    ЛГ обладают сильной флуоресценцией. Флуоресцентные свойства ЛГ обусловлены наличием в них более десятка флуорофоров — производных полностью-транс-ретиналя (ПТР) [7, 12]. Одним из наиболее изученных является А2Е — продукт взаимодействия двух молекул ПТР с аминогруппой одного из липидов фоторецепторной мембраны — фосфатидилэтаноламина [8, 14].
    Состав флуорофоров в ЛГ может меняться с возрастом. В работах [4, 6] было показано, что в хлороформных экстрактах ЛГ из РПЭ кадаверных глаз без видимых патологических изменений относительное содержание как А2Е, так и продуктов его фотоокисления и деградации повышается. Вполне вероятно, что и при некоторых патологиях содержание продуктов модификации А2Е может существенно отличаться от нормы (для определенного возраста). Так, например, предполагается, что гипераутофлуоресценция может быть вызвана повышенным содержанием продуктов фотоокисления А2Е [17, 18]. Так как окисленные формы А2Е могут проявлять токсическое воздействие на клеточные структуры и в отсутствие света [16], становится очевидным необходимость детального изучения их содержания в клетках РПЭ в норме и при патологии. Ранее при изучении модельных систем (облучение синтетического А2Е и суспензии ЛГ светом в видимой области спектра) была показана корреляция между накоплением продуктов фотоокисления и деградации А2Е и сдвигом максимумов спектров поглощения и флуоресценции в коротковолновую область [5, 6, 8]. Можно предположить, что спектральные характеристики аутофлуоресценции глазного дна при некоторых патологиях могут быть отличными от нормы.
    Таким образом, анализ спектров флуоресценции и состава флуорофоров ЛГ мог бы дать дополнительную информацию для развития метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна.
    Цель — проведение анализа спектральных характеристик суспензии клеток РПЭ и состава флуорофоров ЛГ, выделенных из индивидуальных кадаверных глаз в норме и при патологии.
    
    Материал и методы
    Кадаверные глаза получали из Глазного тканевого банка ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» после выделения донорской роговицы для трансплантации с учетом договорных отношений и требований биомедицинской этики.
    Анализ и скрининговый отбор трупного донорского материала проводили по клиническим, половым и возрастным признакам.
    После отбора экспериментального материала врачом-офтальмологом проводился детальный осмотр каждого кадаверного глаза на наличие прижизненных патологических изменений на глазном дне. Описание глазного дна трупного донорского глаза проводили с учетом постмортальных тканевых изменений.
    До офтальмологического описания глазного дна проводили скрининговый осмотр каждого кадаверного глаза. Далее оценивали состояние глазного дна, преимущественно макулярной и парамакулярной областей и диска зрительного нерва. Для проведения осмотра и сохранения целостности и топографии слоя РПЭ глазной бокал фиксировали в нейтральном водном 5%-ном растворе формальдегида в течение 24 часов. После иссечения стекловидного тела и сетчатки приступали к осмотру РПЭ. При этом оценивали степень и равномерность пигментации, истончения, признаков прижизненной атрофии РПЭ, наличия органических включений в макулярной и парамакулярной областях, диаметр, экскавацию диска зрительного нерва и сдвиг сосудистого пучка.
    Всего было проанализировано 25 образцов из РПЭ индивидуальных кадаверных глаз. Из этого количества 24 образца были получены из кадаверных глаз без видимых патологических изменений в РПЭ (норма), а 1 образец — из кадаверного глаза с патологией (см. описание патологии ниже).
    Для детального сравнительного анализа брали 1 образец, полученный из кадаверного глаза без патологии, и 1 образец — с визуально определяемой патологией. Оба глаза были получены от доноров, близких по возрасту, непосредственная причина смерти которых — острая сердечнососудистая недостаточность.
     Осмотр глазного дна без визуально наблюдаемых патологических изменений после удаления нейросенсорного слоя сетчатки (все дефекты РПЭ, полученные при манипуляциях микрохирургическими инструментами, были учтены) показал, что РПЭ равномерный, без очаговой патологии, в макулярных (фовеальных) зонах имеется интенсивная (более насыщенная) пигментация клеток РПЭ, что соответствует нормальной картине глазного дна (рис. 1а).
    При осмотре глазного дна с визуально определяемыми патологическими изменениями в РПЭ были обнаружены следующие характерные признаки этих изменений: РПЭ неравномерный, разряженный, картина «паркетного» глазного дна, в макулярной и парамакулярной зонах наблюдается перераспределение пигмента, множественные друзоподобные отложения в виде желтоватых незначительно проминирующих образований с неровными границами, окруженные зоной гиперпигментации, без тенденции к слиянию (рис. 1б).
    Из описанных выше трупных глаз были получены суспензии клеток РПЭ и зарегистрированы их спектры флуоресценции. Затем были получены хлороформные экстракты, и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проанализирован состав флуорофоров и их относительное содержание в этих хлороформных экстрактах.
    Образцы клеток РПЭ и хлороформные экстракты из кадаверных глаз получали методами, описанными в работе, опубликованной ранее [1].
    В работе были использованы реактивы производства Sigma-Aldrich, Fluka, Компонент-реактив, пластиковые одноразовые пробирки на 1 мл и одноразовые пипетки производства Eppendorf. Для ВЭЖХ использовали растворители производства Sigma-Aldrich и Fluka хроматографической чистоты.
    Спектры флуоресценции суспензии клеток РПЭ регистрировали на флуориметре «Shimadzu RF-5301PC» (Япония). Спектры флуоресценции были нормализованы по максимальному значению флуоресценции. Анализ проводили по изменению положения максимумов флуоресценции.
    Хроматографическое разделение флуорофоров в хлороформных экстрактах из РПЭ проводили на хроматографе фирмы «Knauer» (Германия) с колонкой «Диасфер 120 С18» (4х250 мм, размер сорбента 5 мкм). Разделение проводилось путем линейного градиентного элюирования в системе: от 80% ацетонитрила + 20% воды (+ 0,05% трифторуксусной кислоты) до 100% ацетонитрила за 20 минут; скорость потока — 1,5 мл/мин. Детектирование осуществлялось по поглощению на длине волны 430 нм при помощи спектрофотометрического детектора «Knauer К-2501».
    
    Результаты и обсуждение
    Типичная хроматограмма, полученная при ВЭЖХ-анализе хлороформного экстракта из РПЭ индивидуального кадаверного глаза без визуально наблюдаемой патологии, представлена на рис. 2а. Были идентифицированы пики 5 (окисленная форма А2Е), 6 и 8 (А2Е и изо-А2Е, соответственно) согласно работам [4-6, 14]. Группы пиков 1-4, как предполагается в работе [4], являются продуктами (фото)окисления и деградации А2Е. В образце, полученном из кадаверного глаза с визуально наблюдаемыми патологическими изменениями (рис. 2б), набор пиков для фракции 1 и 2, как можно видеть, более разнообразный.
    На основании данных ВЭЖХ-анализа было вычислено относительное содержание отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в 24 образцах, разделенных на возрастные группы, полученных из кадаверных глаз без патологии, и 1 образца с визуально наблюдаемой патологией. Нами проведена направленная выборка экспериментальных образцов с целью продемонстрировать индивидуальный подход. В этой связи, в наши задачи не входила статистическая обработка больших объемом экспериментального материала (рис. 3). Из диаграммы видно, что с возрастом донора происходит увеличение относительного содержания А2Е (пик 6), а также его продуктов (фото)окисления и деградации (пики/группы пиков 1-5). При этом наблюдается резкое падение относительного содержания в хлороформном экстракте изо-формы А2Е (пик 8).
    Анализ образца, полученного из кадаверного глаза с визуально наблюдаемой патологией в РПЭ (рис. 3, черная полоса, 58 лет), показал, что относительное содержание почти всех компонентов хлороформного экстракта отличается от нормы (в возрастных пределах). Особенно заметна эта разница для группы пиков 1 (их относительное содержание почти в 2 раза меньше). Для всех остальных компонентов хлороформного экстракта их относительное содержание повышено, хотя разница не такая большая, как для группы пиков 1.
    Сравнительный анализ спектров флуоресценции (рис. 4) показал, что для образца с патологией максимум флуоресценции (в области 505 нм) сдвинут по сравнению с максимумом флуоресценции образца в норме (в области 530 нм) в коротковолновую область примерно на 45 нм.
    Таким образом, показано, что с возрастом доноров происходит увеличение относительного содержания А2Е и продуктов его (фото)окисления и деградации в хлороформных экстрактах, полученных из РПЭ индивидуальных кадаверных глаз без видимых патологий. При наличии визуально наблюдаемой патологии в РПЭ отмечается изменение относительного состава флуорофоров хлороформного экстракта из РПЭ, а именно: уменьшение относительного содержания продуктов 1-й группы пиков, увеличение относительного содержания продуктов 2-й группы пиков и увеличение содержания А2Е. При этом меняется и суммарный спектр флуоресценции исследуемого хлороформного экстракта: максимум спектра смещается в коротковолновую область.
    Описанные выше результаты хорошо согласуются с ранее обнаруженной нами корреляцией между накоплением продуктов (фото)окисления и деградации А2Е при облучении как самого А2Е, так и суспензии ЛГ, и смещением максимума спектра флуоресценции в коротковолновую область [4-6].
    Результаты данных исследований дают основание предположить, что спектральные характеристики АФ глазного дна in vivo могут также быть различными в норме и при патологии. В этой связи становится очевидной необходимость проведения исследования флуоресцентных свойств ЛГ в более нативной системе, а именно в клетках РПЭ без нарушения целостности его структуры (эксперименты in situ) с использованием метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
    
    Выводы
    Как показано в экспериментах in vitro, относительный состав флуорофоров ЛГ и спектры флуоресценции суспензии клеток РПЭ, полученного из отдельного кадаверного глаза с визуально наблюдаемыми патологическими изменениями, отличаются от таковых в норме.
    Возможность анализа спектральных характеристик АФ in situ, а в дальнейшем in vivo экспериментах позволила бы существенным образом повысить информативность неинвазивного метода АФ глазного дна.
    Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» и гранта РФФИ № 12-04-00844.


Страница источника: 54

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Восток – Запад 2017 Международная научно-практическая конференция по офтальмологииВосток – Запад 2017 Международная научно-практическая конфер...

Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru