Online трансляция


Научно-практическая конференция с международным участием
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий
Москва. Гостиница Holiday Inn Sokolniki
4 февраля 2017 г.



15-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Современные технологии лечения витреоретинальной патологии
Сочи, 16-17 марта 2017
Официальный сайт

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 22 2016
№ 21 2016
№ 20 2015
№ 19 2015
№ 18 2015
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
№ 1 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
№ 1 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
№ 2 (28) Апрель 2016
№ 1 (27) Март 2016
....


Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.713-004.1

Конструирование биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов кожи


1МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» Минздрава РФ
2Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

     По данным ВОЗ в 2010 г. заболевания роговицы явились причиной слепоты 8 млн. людей во всем мире. При тяжелых осложненных бельмах операцией выбора является протезирование роговицы [2-4, 6, 9, 14, 15, 18]. Риск развития протрузии кератопротеза наиболее велик при лечении истонченных и неравномерных по толщине бельм. Имплантация сквозного кератопротеза в такие бельма требует предварительного укрепления бельма с целью повышения его прочностных свойств и профилактики асептического некроза, что, как правило, отодвигает сроки реабилитации больных на 5-12 мес. [3, 4, 6, 9, 15, 18]. В 1996 г. отечественными офтальмологами ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» [10] была предложена новая методика лечения истонченных и неравномерных бельм с использованием роговично-протезного комплекса, сочетающая одновременно несколько видов хирургических вмешательств — кератопластику и два этапа кератопротезирования. Технология изготовления роговично-протезного комплекса состояла в предоперационной имплантации опорного элемента кератопротеза (ОПК) Федорова-Зуева в интрастромальные слои трупной донорской роговицы с последующей модификацией коллагеновых волокон дубящими составами альдегидных соединений, что позволило снизить долю отторжения роговично-протезного комплекса до 3,8% против 10,9% при протезировании за счет повышения устойчивости роговицы к протеолитическим ферментам слезы и влаги передней камеры .

    На сегодня наиболее эффективной и безопасной техникой повышения биомеханической прочности роговицы является кросслинкинг роговичного коллагена, основанный на эффекте фотополимеризации стромальных волокон под воздействием фоточувствительной субстанции рибофлавина, и низких доз ультрафиолетового излучения твердотельного UVA-источника [17, 20].

    В результате фотохимических реакций происходит утолщение коллагеновых волокон, повышение ригидности роговицы и ее устойчивости к действию протеолитических ферментов.

     Перспективным направлением регенеративной медицины является создание биоинженерных конструкций, замещающих и восстанавливающих поврежденные ткани организма. Подобные трансплантаты уже широко используются в комбустиологии, урологии, стоматологии, офтальмологии и других клинических областях медицины [1, 5, 7, 8, 11-13, 16, 19]. На примере использования «живого эквивалента дермы» (культивированных фибробластов кожи в трехмерном коллагеновом геле) показано, что помимо выработки фибробластами факторов роста, коллагена I и II типов, компонентов внеклеточного матрикса, происходит трансформация фибробластов в миофибробласты, контракция геля и образование структуры, похожей на соединительную ткань [1, 7, 13, 16].

    Цель

     Разработка и обоснование преимуществ технологии изготовления конструкции биокератопротезного комплекса (БКПК) на основе кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы и культивированных фибробластов кожи для повышения качества трансплантата при использовании его в лечении тяжелых осложненных бельм.

    Материал и методы

    Исследования in vitro. Метод кросслинкинга роговичного коллагена. В эксперименте использовалось 36 кадаверных роговиц человека, невостребованных для трансплантации. Для имплантации титановой ОПК модели Федорова-Зуева на глубине 2\3 толщины стромы роговицы был сформирован карман 6х8 мм, соответствующий размерам пластинки. Часть роговиц (N=12) в качестве контроля помещали на 14 суток в среду DMEM (Биолот, Россия), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США). Затем для морфологических исследований роговицы фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина. Остальные 24 роговицы помещали на 1 час в раствор, содержащий 5%-ный декстран и 0,1%-ный рибофлавин, после чего роговицы облучали ультрафиолетом с помощью прибора для кросслинкинга роговичного коллагена UV-X™ (IROC, Швейцария) мощностью 3 МВт/см² (5,4 Дж/см²) длиной волны 365 нм, сфокусированной на 12 мм от вершины роговицы . Общее время манипуляции составило 30 минут, при этом каждые 5 минут на поверхность роговицы наносился раствор 0,1%-ного рибофлавина.

    Метод выделения и культивирования фибробластов. Фибробласты выделялись из биоптата кожи взрослого человека с помощью механической дезагрегации и ферментативной обработки 0,1%-ной коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующими отмывкой и центрифугированием. Клеточный осадок трижды отмывался в среде DMEM. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС. На 3-м пассаже культуры фибробластов трансфицировали геном зеленого флуоресцирующего белка GFP под CMV-промотором при помощи лентивирусной конструкции (ООО «Евроген», Россия) для возможности их прижизненной визуализации с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX51 (Olympus, Япония). Часть трансфицированных клеток пассировали на титановый опорный элемент кератопротеза Федорова-Зуева и культивировали в течение 7 суток в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС. Другую часть клеток смешивали с микроносителями CultiSpher-S (Percell, HyСlone, США), представляющими собой биодеградируемые желатиновые сферы диаметром 100-200 мкм с неровной поверхностью, в соотношении 106 клеток на 1 мл микроносителей. Культивирование проводилось в течение 7 суток в среде DMEM c 10% ЭТС.

    Моделирование конструкции БКПК. Использовались ОПК модели Федорова-Зуева, которые вводились в интрастромальный карман кросслинкинг-модифицированной роговицы. Далее при помощи автоматической пипетки в интрастромальные карманы роговиц инъецировали 200 мкл суспензии культивированных фибробластов на микроносителях (2 млн. кл/мл). Полученные конструкции (рис. 1) инкубировали в стандартных культуральных условиях: 5% СО2, 100% влажность, 370 С. Наблюдение с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа проводили на 1, 3, 7 и 14 сутки.

     Для проведения сканирующей электронной микроскопии на растровом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI, Нидерланды), гистологических и иммуногистохимических исследований полученные конструкции биокератопротезных комплексов фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина. Для идентификации и подтверждения жизнеспособности введенных клеточных элементов использовалась иммуногистохимическая окраска антителами против зеленого белка EGFP (Invitrogen, США), альфа-актина (Abcam, США). Ядра клеток окрашивались DAPI (Invitrogen, США).

    Исследования in vivo. Экспериментальные исследования проводились на 30 кроликах-самцах породы Шиншилла весом 2,5-3 кг. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало рекомендациям Хельсинской декларации и рекомендациям, содержащимся в Директивах Европейского сообщества (№ 86/609 EC). При моделировании эксперимента на животных учитывался факт наличия у кроликов тонких (400 мкм) и больших в диаметре (15 мм) роговиц, что существенно затрудняло введение ОПК в интрастромальный карман трупной донорской роговицы кролика и проведение хирургических манипуляций. В связи с этим нами предложено экспериментальное моделирование имплантации БКПК путем введения в строму роговиц животных имплантата, представляющего собой 1\4 роговицы кролика, в интрастромальный карман которой введена 1\4 ОПК Федорова-Зуева (рис. 2). При этом для проведения сравнительных исследований реакции роговицы на введение имплантатов с различными характеристиками было сформировано 4 опытные группы. Контролем являлось введение в строму кролика имплантата, состоящего из 1\4 нативной донорской роговицы и 1\4 ОПК (см. таблицу).

    Выделение, культивирование, трансфецирование фибробластов, кросслинкинг трупных роговиц кроликов, инкубирование имплантатов проводились по вышеуказанным протоколам. Под общей анестезией Zoletil («Virbac Sante Animale», Франция) концентрично склеральной части лимба производился разрез роговицы на глубину 2/3 её толщины, протяжённостью 3 мм. Через полученный разрез при помощи шпателя производилось расслаивание стромы до средней её периферии на одном уровне. Имплантат при помощи пинцета и шпателя вводился в интрастромальный карман. Операционная рана ушивалась узловыми швами (шёлк 8/0). Выведение животных из эксперимента проводилось на сроках 7 суток и 3 мес.

    Результаты

    Результаты исследований in vitro. С помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии (ФЭМ) показано, что к 5 суткам поверхность титановой ОПК была заселена многоотростчатыми фибробластоподобными клетками. По данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) коллагеновые волокна кросслинкинг-модифицированной стромы имели более плотную упаковку по сравнению со стромой интактных роговиц (рис. 3а, б). Результаты ФЭМ и иммуногистохимических исследований показали наличие жизнеспособных клеточных элементов внутри интрастромального кармана и в толще стромы роговицы. В результате окрашивания на маркер миофибробластов альфа-актин выявлена флуоресценция, подтверждающая наличие данного белка в клетках, начиная с 7 суток культивирования (рис. 4). К этому же сроку начинали образовываться тонкие фибриллы между поверхностями микроносителей и стромой роговицы в виде перемычек (рис. 5), и наблюдалась биодеградация желатиновых микросфер с их начальной интеграцией в ткани роговицы. Таким образом, на сроке 7 суток инкубирования БКПК может быть использован для имплантации.

    Результаты исследований in vivo. Гистологические исследования показали, что имплантаты с кросслинкинг-модифицированной стромой отличались плотной упаковкой волокон по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения. В опытных образцах, не содержащих клеточную культуру (№ 1 и 2), на ранних сроках отмечали отсутствие клеточных элементов в имплантате, в то время как в контроле и группах № 3 и 4 присутствовали фибробластоподобные клетки. В строме собственной роговицы клеточной активности во всех группах не наблюдали.

    На сроке 3 мес. в группах, где использовали культуры клеток и желатиновые микроносители, в имплантате и собственной строме роговицы отмечали наличие фибробластоподобных клеток, немногочисленных новообразованных сосудов, визуализировались фиброзная капсула, выстилающая полость интрастромального кармана, распадающиеся микроносители, инфильтрированные полиморфными клеточными элементами, с интеграцией в строму. В контрольной и опытной группах № 1 фиброзной капсулы отмечено не было (рис. 6а-б). Бoльшая выраженность, полноценность и тенденция к продолжению созревания капсулы, а также большее количество новообразованных сосудов на единицу площади отмечалось в опытной группе № 3 (рис. 6в-д).

    Обсуждение

    Проведение процедуры кросслинкинга на аллогенных донорских роговицах по данным лабораторных исследований позволило увеличить плотность коллагеновых волокон стромы, что особенно важно при использовании протезных конструкций. Биологическая инертность ОПК из титанового материала подтверждена выраженной адгезией фибробластов, формированием клеточного монослоя и дальнейшей пролиферацией клеток. Желатиновые микроносители, примененные в качестве трехмерного матрикса, способствовали малотравматичному введению клеток в интрастромальный карман роговицы и являлись дополнительным субстратом для синтеза межклеточного вещества. Внутри кармана и в толще стромы культивированные фибробласты в 3D-условиях дифференцировались в миофибробласты, что способствовало развитию контракции, образованию прочной фиброзной ткани вокруг ОПК.

    Использование аутологичных фибробластов, введенных в интрастромальный карман роговицы, способствовало развитию более выраженного фиброза и образованию сосудов в участках стромы, прилегающих к ОПК, что обеспечивает трофику тканей, особенно необходимую в верхних слоях бельма.

    Заключение

    Таким образом, разработанная конструкция БКПК обладает рядом преимуществ за счет повышения прочностных свойств «сшитой» стромы роговицы и введения фибробластов на микроносителях, способствующих развитию пролиферативных процессов, направленных на поддержание трофики, формирование прочной фиброзной ткани вокруг ОПК, профилактику кератомаляции и протрузии ОПК.


Страница источника: 72
Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Занимательная аккомодологияЗанимательная аккомодология

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Заболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторонЗаболевания глазной поверхности. Взгляд со всех сторон

Интересное об известномИнтересное об известном

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru