Online трансляция


Трансляция симпозиумов в рамках Международного офтальмологического конгресса
Белые ночи
Белые ночи
Санкт-Петербург
29 мая - 2 июня 2017 г. Трансляция проводится из двух залов:
Зал «Стрельна»
Зал «Санкт-Петербург»


Международная конференция по офтальмологии
Восток–Запад
Восток–Запад
Уфа
8 - 9 июня 2017 г.

Партнеры


Valeant thea
Allergan Фокус
santen tradomed
sentiss



Издания


Российская офтальмология онлайн Российская
Офтальмология Онлайн

№ 24 2017
№ 23 2016
№ 22 2016
№ 21 2016
...
Журнал Офтальмохирургия Журнал
Офтальмохирургия

№ 1 2017 г.
№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
...
Журнал Новое в офтальмологии Новое в
офтальмологии

№ 1 2017 г.
№ 4 2016 г.
№ 3 2016 г.
№ 2 2016 г.
...
Российская детская офтальмология Российская
детская офтальмология

№ 1 2017
№ 4 2016
№ 3 2016
№ 2 2016
...
Современные технологии в офтальмологии Современные технологии
в офтальмологии

№ 1 2017
№ 5 2016
№ 4 2016
№ 3 2016
...
Восток – Запад Восток - Запад.
Точка зрения

Выпуск 4. 2016
Выпуск 3. 2016
Выпуск 2. 2016
Выпуск 1. 2016
...
Новости глаукомы Новости
глаукомы

№1 (41) 2017
№1 (37) 2016
№1 (33) 2015

....
Мир офтальмологии Мир офтальмологии
№1 (33) Март 2017
№ 6 (32) Декабрь 2016
№ 5 (31) Октябрь 2016
№ 3 (29) Июнь 2016
....


facebooklogo     youtubelogo



Сборники статей


 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:617.713-004.1-085

Антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF на экспериментальной модели васкуляризации роговицы по результатам морфологических исследований


1Центральная клиническая больница Российской академии наук
2Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина Российской академии наук

Известно, что патологический ангиогенез может быть подавлен не только путем блокирования биологических эффектов стимуляторов ангиогенеза, но и путем усиления его природных ингибиторов. Многообещающие средства от рака, эндостатин и ангиостатин, открытые Джудой Фолкменом и его коллегами, породившие бурю оптимизма, из-за низкой эффективности в качестве противораковых препаратов были со временем незаслуженно забыты. Между тем, современные публикации свидетельствуют о возможности применения природных ингибиторов ангиогенеза при заболеваниях глаз, сопровождающихся неоваскуляризацией. В связи с чем мы провели серию экспериментальных исследований, направленных на изучение этой проблемы. В исследованиях in vitro и in vivo (клинически) был выявлен ангиостатический эффект 3-х тестируемых природных ингибиторов: эндостатина, тумстатина и фактора, выделенного из пигментного эпителия сетчатки — PEDF [2].

Цель

Изучить морфологически на световом уровне антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF.

Материал и методы

Изучали с помощью морфологических методов исследований антиангиогенные эффекты природных ингибиторов ангиогенеза тумстатина, эндостатина и PEDF. Пептиды целевого назначения были созданы с помощью биотехнологии генной инженерии (лаборатория биотехнологий ИБХ РАН, зав. лаб. — акад. Мирошников А.И.) [2].

Биологическую активность тестируемых пептидов изучали in vivo на моделях заболеваний глаза, протекающих с ангиогенезом. Модель ангиогенеза формировали путем прошивания роговицы с лимба викриловыми швами (8-0) [1, 4]. При выборе экспериментальной модели ангиогенеза ориентировались на простоту воспроизведения, доступность визуального контроля ангиогенеза и гистогенетическую приближенность к существующим в природе неоваскулярным заболеваниям переднего отрезка глаза [1, 3].

После обездвиживания животного 1% раствором ксилы и инстилляционной местной анестезии 1% раствором дикаина на глаз накладывали векорасширитель. Модель формировали на двух глазах 6 кроликов (12 глаз) породы шиншилл (половозрелые самцы, вес — 2,5-3 кг). В качестве контроля служили правые глаза животных (6 глаз), опытным был левый глаз (6 глаз). Начиная с первого дня (день прошивания роговицы) эксперимента ежедневно под конъюнктиву в рекомендуемых концентрациях (7,2 нМ PEDF, 70,2 нМ эндостатина, 70,2 нМ тумстатина) вводили один из антиангиогенных пептидов в указанной концентрации. Делали по 10 субконъюнктивальных инъекций в каждый опытный глаз.

Животных в эксперименте лечили в полном соответствии с Резолюцией ARVO «По использованию животных в экспериментальных исследованиях», Принципами лечения лабораторных животных (публикация № 86-23 в NIH от 1985 г.) и ныне действующими правилами GMP (Good Medical Practice) [4].

Всех животных выводили из эксперимента на 15 сутки. Их глаза были энуклеированы и фиксированы в 10% нейтральном формалине. Из целого фиксированного глаза готовили центральную колодку, проходящую через центр роговицы, которую в дальнейшем заливали в парафин и готовили срезы (толщиной 3-5 мкм). Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону. Окрашенные препараты исследовали на световом «Фотомикроскопе-Ш» (Орton, Германия). С каждого глаза (n=12) готовили по 16 срезов роговицы (по 3 среза в 4 квадрантах), 16 срезов радужки (по 3 среза в 4 квадрантах) и 16 срезов хориоидеи (по 3 среза в 4 квадрантах). Всего было проанализировано морфологически на световом уровне 576 срезов.

Ангиостатический эффект тестируемых пептидов оценивали морфологическим, иммуногистохимическим, морфометрическим и колориметрическим методами.

Морфометрический анализ заключался в сравнительном изучении характера патоморфических изменений тканей глаза на фоне проводимого эксперимента, в подсчитывании количества новообразованных сосудов, врастающих в роговицу по ходу швов с лимба, и общей площади их просвета. Параллельно анализировали площадь распространения клеточного инфильтрата и состав клеток вокруг измеряемого сосуда. Расчеты проводили на участке роговицы, непосредственно прилежащей к швам и потому отличавшейся наибольшей выраженностью процесса.

Иммуногистохимические исследования (ИГХ) заключались в количественной оценке экспрессии маркера эндотелиальных клеток (ЭК) CD31 в тканях глаза. ИГХ проводили следующим образом. Парафиновые срезы депарафинизировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» АГ проводили» в течение 45 мин., используя водяную баню с цитратным буфером, нагретым до 95-99°С. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. и в фосфатном буфере — в течение 5 мин. Эндогенную пероксидазу блокировали 20-минутной инкубацией в темноте с 3% перекисью водорода, после чего промывали срезы в фосфатном буфере. Инкубацию с первичными АТ проводили при комнатной температуре в течение 40 мин. После первичных АТ стекла промывали 2 раза по 5 мин. в фосфатном буфере. Инкубация с АТ, меченными стрептавидином [LSAB®+ kit, DAKO], проводили при комнатной температуре в течение 20 мин., затем срезы промывали 3 раза по 5 мин. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB + систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 2-х мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Негативным контролем служила ИГХ реакция без добавления первичных АТ.

Оценку результатов ИГХ проводили на световом микроскопе «Аxiolab» E-re (фирма-производитель «Carl Zeiss», Германия). Использовали увеличение х400. Анализировали локализацию маркера и характер окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Применяли следующие критерии оценки иммуногистохимической реакции:

• отрицательной считали реакцию при отсутствии специфического окрашивания клеток;

• положительной реакцией считали наличие в препарате специфически окрашенных клеток.

Колориметрический анализ заключался в специальном техническом приеме, который применяли для подсчета индекса васкуляризации.

Методика подсчета индекса васкуляризации.

1. Производилась серия снимков различных участков среза лимбороговичной ткани, проходящей вокруг шва.

2. С помощью программы Photoshop (инструмент «овальная область») выделяли пиксели, составляющие изображение просвета сосудов в срезе (рис. 1а, б) и подсчитывали их количество (данные внесены в табл. 1 в столбце количество пикселей сосудов).

3. Затем полученная цифра делилась на общее количество пикселей изображения, таким образом получали показатель, именуемый далее как индекс васкуляризации для участка гистологического препарата, отображенного на снимке. Результаты представляли собой промежуточные индексы васкуляризации.

4. Для нахождения индекса васкуляризации всего препарата, мы находили среднее арифметическое из всех промежуточных индексов васкуляризации на каждом глазу.

Статистический анализ проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, SPSS. Линейные величины сравнивали по методу Стьюдента, при малой выборке использовали точный двусторонний тест Фишера. Достоверным считали отличие при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Было установлено морфологически на световом уровне, что все 3 препарата обладают сопоставимыми антиангиогенными эффектами.

Это проявляется достоверным снижением количества новообразованных сосудов на единицу площади тканевого среза в зоне просмотра по результатам морфометрических исследований, соответственно (р<0,001) (табл. 1). При этом колориметрические показатели суммарного просвета сосудов на срезе в пикселях достоверно снижаются (р<0,001), как и индекс васкуляризации лимбо-роговичной зоны (р<0,001).

Тумстатин и PEDF обладают более мощным антиангиогенным эффектом. Эндостатин по степени выраженности биологических эффектов значительно уступает им.

При исследовании роговицы методом световой микроскопии обращала на себя внимание различная степень выраженности отека (плотность и глубина распространения) и клеточной инфильтрации роговицы вокруг экспериментальных швов. Инфильтрат преимущественно состоял из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов.

Сравнительные аспекты количественной оценки противоотечного и противовоспалительного эффекта антиангиогенных препаратов продемонстрировали преимущества эндостатина (рис. 2а, б) перед двумя другими пептидами тумстатином (рис. 3а, б) и PEDF (рис. 4а, б). Все 3 препарата достоверно снижали количество клеточных элементов в инфильтрате, развившемся вокруг викриловых швов (табл. 2).

Однако доля эозинофилов в инфильтрате, развившемся вокруг шва на фоне эндостатина, была достоверно выше, чем на фоне применения тумстатина и PEDF. Более того, меньшая доля эозинофилов в инфильтрате, развившемся вокруг шва на фоне PEDF, свидетельствовала о возможном десенсибилизирующем / противоаллергическом / противовоспалительном потенциале этого пептида.

Из других патоморфологических изменений были отмечены следующие. Собственно эндотелий роговицы был дистрофически изменен во всех исследуемых опытных и контрольных глазах. Во всех исследуемых глазах обнаружены передние синехии в области экспериментальных дефектов. Они объяснялись перифокальным воспалением, которое возникало вокруг викриловых швов, проходящих насквозь роговицы, и контактирующих с тканями передней камеры глаза.

На светооптическом уровне токсического влияния исследуемых препаратов на эндотелий нормальных сосудов радужки и хориоидеи не обнаружено.

На первый взгляд, иммуногистохимические исследования с маркером CD31 казались неинформативными и непригодными для наших целей. Положительная ИГХ-реакция была обнаружена в эндотелии собственных сосудов радужной оболочки, в то время как в новообразованных сосудах в грануляционной ткани вокруг искусственных дефектов роговицы ИГХ-реакция на маркер CD31 оказалась отрицательной.

В связи с этим можно было предположить, что экспрессия CD31 начинается не сразу с момента образования сосудов, а несколько отсрочено в процессе во времени — к этапу их созревания. Это делает ИГХ-реакцию с маркером CD31 неприменимой для подсчета индекса васкуляризации в нашем эксперименте. Зато полученную негативную реакцию можно было расценивать как факт развития неполноценных новообразованных сосудов, не содержащих слоя эндотелиальных клеток в стенке. В этом, по-видимому, и проявлялся один из антиангиогенных эффектов используемых ингибиторов ангиогенеза.

В целом морфологические исследования подтверждали эффективность тестируемых ингибиторов ангиогенеза на ранних стадиях неоангиогенеза. (Ангиостатические пептиды вводились в эксперименте одновременно с индукторами ангиогенеза.) Вместе с тем, утверждать, что они будут эффективны и на поздних стадиях этого процесса, нельзя. Их пригодность в качестве аваскулогенных препаратов должна быть подтверждена в других моделях ангиогенеза, на более поздних его стадиях, в частности, на зрелых уже сформированных сосудах.

Выводы

1. Проведенные морфологические исследования позволяли утверждать, что все 3 тестируемые пептиды обладают заявленными ангиостатическими свойствами, что проявляется уменьшением интенсивности ангиогенеза в ответ на его индукцию викриловыми швами: достоверно снижается количество новообразованных сосудов на единицу площади ткани, а также уменьшается суммарный индекс васкуляризации на срезе.

2. Отсутствие ЭК в стенке новообразованных сосудов позволяет высказать предположение, что к антиангиогенным эффектам пептидов следует также отнести торможение миграции и пролиферации ЭК и/или усиление апоптоза ЭК. Негативная ИГХ-реакция с маркером ЭКCD31 новообразованных сосудов на фоне CD31-позитивной реакции ЭК сосудов радужной оболочки — подтверждает этот вывод.

3. Наряду с антиангиогенной активностью тестируемые пептиды обладали противоотечными и антипролиферативными эффектами, проявляющимися в уменьшении количества клеточных элементов вокруг викрилового шва и сокращении площади клеточной инфильтрации.

Экспериментальные исследования, представленные в статье, проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (ГК № 02.740.11.0717).


Страница источника: 65

Новые технологии в контактной коррекции.  В рамках  Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии - 2017»Новые технологии в контактной коррекции. В рамках Всеросси...

Новые технологии в офтальмологии -  2017 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии - 2017 Всероссийская научн...

XVI Всероссийская школа офтальмологаXVI Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017 ХV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Роговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении кератоэктазий Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица I. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы в лечении...

Сателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХIV ежегодного конгресса Рос...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016«Живая» хирургия в рамках конференции Современные технологии...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2016Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках IX Российского общенациональ...

На стыке науки и практикиНа стыке науки и практики

Федоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2016 XIII Всероссийская научно-практиче...

Актуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XI Всероссийская научная к...

Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтальмохирургии с международным участием Восток – Запад 2016 Научно-практическая конференция по офтал...

Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2016 Сателлитные симпозиумы в рамках Международ...

Невские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологовНевские горизонты - 2016 Научная конференция офтальмологов

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмологов «Невские горизонты - 2016»Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции офтальмо...

Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-практическая конференция Новые технологии в офтальмологии 2016 Всероссийская научно-п...

Витреоретинальная хирургия. Макулярный разрывВитреоретинальная хирургия. Макулярный разрыв

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2016 ХIV Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта использования новой офтальмологической системы CENTURION®Совет экспертов, посвященный обсуждению первого опыта исполь...

HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незаменимой!HRT/Spectralis* Клуб Россия 2015 – технология, ставшая незам...

Три письма пациента. Доказанная эффективность леченияТри письма пациента. Доказанная эффективность лечения

Синдром «сухого» глаза: новые перспективыСиндром «сухого» глаза: новые перспективы

Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?Многоликий синдром «сухого» глаза: как эффективно им управлять?

Прошлое... Настоящее! Будущее?Прошлое... Настоящее! Будущее?

Проблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиумПроблемные вопросы глаукомы IV Международный симпозиум

Секундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT Lisa Tri ToricСекундо В. Двухлетний личный опыт с линзами AT Lisa Tri и AT...

Инновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной хирургииИнновации компании «Алкон» в катарактальной и рефракционной ...

Применение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических ИОЛ HOYA iSert Toric в рефракционной хирургии катарактыПрименение устройств HOYA iSert Toric. Применение торических...

Рейтинг@Mail.ru